崔　龍　趙　娟

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檜木醇對(duì)腎癌786-O細(xì)胞增殖及相關(guān)細(xì)胞因子的影響

崔龍趙娟

目的從體外水平研究檜木醇(hinokitio1)的抗腎癌作用，探討其作用機(jī)制。方法采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檜木醇對(duì)腎癌786-O細(xì)胞增殖的抑制作用和促凋亡作用的影響；采用Western-blot檢測(cè)檜木醇對(duì)人腎癌786-O細(xì)胞Caspase-3剪切體、LC3和P62蛋白表達(dá)水平的影響。以3-MA驗(yàn)證其抗癌作用與自噬作用的關(guān)系。結(jié)果檜木醇對(duì)腎癌786-O細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，主要是通過(guò)激活Caspase 途徑對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)。同時(shí)檜木醇可以對(duì)腎癌786-O細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)自噬發(fā)生，使LC3蛋白的表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)，而P62蛋白表達(dá)則顯著下調(diào)。結(jié)論檜木醇能夠顯著抑制腎癌786-O細(xì)胞的增殖，而且可以通過(guò)過(guò)度激活細(xì)胞自噬促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡。

腎癌；786-O細(xì)胞；檜木醇；自噬

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.004

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1056～1058)

腎癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，在男性腫瘤中死亡率居第6位，在女性腫瘤中死亡率居第8位[1]。腎癌患者癥狀大多表現(xiàn)不明顯，目前當(dāng)確診為腎癌時(shí)，患者中有20%～30%已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。腎癌的形成是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的病理過(guò)程，與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，但是其中還包括了表觀遺傳學(xué)方面的異常，具體發(fā)病機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[2]。檜木醇(hinokitio1)，是提取于柏科植物的一種天然化合物[3]，通過(guò)國(guó)內(nèi)外同行的多年研究發(fā)現(xiàn)其在抗菌、抗氧化、抗炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)分化等方面有重要的作用[4-5]，而近年對(duì)于其抗腫瘤的特性研究最為廣泛，且其抗腫瘤作用可能與其DNA的凋亡和損傷誘導(dǎo)作用有關(guān)[6-8]。本研究主要在于探討檜木醇是否有抗腎癌作用，并且對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人腎癌細(xì)胞株786-O(來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；檜木醇(來(lái)源于美國(guó)Sigma公司)；Z-VAD-FMK及3-MA(來(lái)源于美國(guó)Enzo公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(來(lái)源于美國(guó)Hyclone公司)；MTT檢測(cè)試劑盒(來(lái)源于美國(guó)Invitrogen公司)；Lipofectamine 2000(來(lái)源于美國(guó)Invitrogen 公司)；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(來(lái)源于美國(guó)BD公司)；本研究中抗體均從美國(guó)Cell Signaling Technology公司購(gòu)買。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人腎癌786-O細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS及100 mg/L鏈霉素、 100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基放置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為：對(duì)照組(0 mmol/L檜木醇組)和實(shí)驗(yàn)組[加入不同濃度檜木醇(2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L)]。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，取出各組細(xì)胞震蕩重懸離心使其在液體中分布均勻，調(diào)整細(xì)胞使其濃度為2×104個(gè)/ml，然后以100 μl/孔加入到96孔板中。各組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。48 h作用后，準(zhǔn)備好濃度為5 g/L的MTT溶液，每個(gè)孔加入20 μl MTT溶液，進(jìn)行孵育4 h，吸棄上清液。隨后向每個(gè)孔中加入DMSO 150 μl，置于振蕩器上進(jìn)行10 min震蕩，使結(jié)晶全部溶解。在490 nm條件下用酶標(biāo)儀進(jìn)行光密度值(OD)測(cè)定，增殖率=試驗(yàn)組/對(duì)照組×100%。此次實(shí)驗(yàn)做3次重復(fù)。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平給予相應(yīng)藥物作用的細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后，取出各組786-O細(xì)胞，進(jìn)行PBS洗滌預(yù)冷，然后按1×10/mL的密度進(jìn)行重懸，再各取500 μl細(xì)胞加入流式管，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，進(jìn)行震蕩離心，混合均勻后在避光的條件下放置15 min進(jìn)行孵育，隨后使用流式細(xì)胞儀定量對(duì)各組細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，此次實(shí)驗(yàn)做3次重復(fù)。

1.2.4Western-blot 檢測(cè)處理48 h后，吸棄培養(yǎng)基后，PBS冰浴沖洗，96孔板中加入RIPA裂解液。按照標(biāo)準(zhǔn)操作完成蛋白的提取。蛋白定量(BCA蛋白定量法)后，隨后將5×蛋白上樣緩沖液加入孔中，然后在95 ℃條件下進(jìn)行煮10 min。SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到NC膜上，后以5%BSA將其封閉1 h。再加一抗于4 ℃放置過(guò)夜，用TBST洗膜后，加二抗后室溫1 h孵育，隨后ECL化學(xué)發(fā)光液5 min孵育，以Image Quant 凝膠成像系統(tǒng)儀對(duì)開(kāi)展顯影觀察，用β-actin作內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1檜木醇對(duì)人腎癌786-O細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)檜木醇濃度為2.5 μmol/L時(shí)，24 h藥物處理使腎癌786-O細(xì)胞增殖活力受到顯著抑制(P<0.05)，并且在本實(shí)驗(yàn)中腎癌786-O細(xì)胞檜木醇抑制作用呈現(xiàn)一定程度的藥物濃度依賴性增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)檜木醇濃度分別為2.5、5.0、10.0 μmol/L，腎癌細(xì)胞的增殖率分別為62.8%、27.6%、14.2%。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)腎癌786-O細(xì)胞凋亡的變化

為Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎癌細(xì)胞死亡率結(jié)果表明，當(dāng)給藥濃度為2.5 μmol/L時(shí)，檜木醇作用24和48 h后，隨著時(shí)間得增加，腎癌786-O細(xì)胞的死亡率也存在增加的趨勢(shì)。2個(gè)時(shí)間點(diǎn)(檜木醇作用24、48 h后)Annexin V+/PI-細(xì)胞比率依次是1.03%和5.02%，Annexin V+/PI+比率依次是5.78%和24.8%。

2.3檜木醇對(duì)腎癌786-O細(xì)胞Caspase-3、LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)水平的影響

Caspase-3作為凋亡主要的最終執(zhí)行者之一，細(xì)胞凋亡情況可以通過(guò)其含量高低直接反映出來(lái)[7]。經(jīng)Western blot檢測(cè)，在2.5 μmol/L檜木醇處理24 h后，腎癌786-O細(xì)胞Caspase-3蛋白含量顯著升高(P<0.05)；LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量有明顯上升現(xiàn)象(P<0.05)，而P62蛋白的表達(dá)量有明顯下降現(xiàn)象(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　檜木醇對(duì)腎癌786-O細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的影響

2.4檜木醇細(xì)胞增殖抑制作用與細(xì)胞自噬的關(guān)系

本研究中加入自噬上游抑制劑來(lái)進(jìn)一步闡明檜木醇對(duì)腎癌細(xì)胞的抑制作用和自噬作用的關(guān)系。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，2 mmol/L的3-MA 24 h能夠顯著抑制由2.5 μmol/L檜木醇帶來(lái)的腎癌細(xì)胞增殖抑制作用(P<0.05)。其中3-MA是典型的自噬上游抑制劑，本結(jié)果提示，檜木醇的抗腫瘤作用可能與腫瘤細(xì)胞自噬作用有關(guān)。

表2　檜木醇與3-MA對(duì)腎癌786-O細(xì)胞生存率的影響/%

3　討論

近年不少研究結(jié)果顯示，肥胖和糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生率不斷升高帶來(lái)的患者罹患腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的不斷提高。作為一種天然提取物，近年研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)檜木醇具有抗肺癌、直腸癌和乳腺癌的作用[7-9]，然而對(duì)于腎癌的研究鮮有報(bào)道。本次研究結(jié)果表明檜木醇能夠很大程度上對(duì)腎癌786-O細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用(P<0.05)，且一定程度上呈現(xiàn)出劑量依賴性增長(zhǎng)趨勢(shì)，且其對(duì)腎癌細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用(P<0.05)。在2.5 μmol/L檜木醇處理24 h后，腎癌786-O細(xì)胞Caspase-3蛋白含量顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明檜木醇帶來(lái)的腎癌786-O細(xì)胞凋亡作用可能是通過(guò)Caspase途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的；同時(shí)檜木醇處理后LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，P62蛋白的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。

近年來(lái)，自噬在生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域是一大熱點(diǎn)。自噬主要有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞能量代謝兩個(gè)方面的作用。在自噬泡內(nèi)，物質(zhì)被酸性水解酶水解后形成糖原和脂肪酸等小分子物質(zhì)，然后重新釋放至胞質(zhì)內(nèi)，繼續(xù)參與到物質(zhì)的代謝功能或再循環(huán)的過(guò)程中[10]。

目前由于自噬的作用較為復(fù)雜，所以在腫瘤中的作用尚且不是很清楚[11]。在生理狀態(tài)正常的情況下，自噬的抗癌作用主要通過(guò)清除受損的線粒體、胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS和錯(cuò)誤的折疊蛋白，來(lái)對(duì)基因組的穩(wěn)定性和DNA的完整性進(jìn)行維持。然而在腫瘤發(fā)生后，自噬能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在低氧、低營(yíng)養(yǎng)條件下的存活，主要通過(guò)給腫瘤細(xì)胞供給能量來(lái)實(shí)現(xiàn)[12]。近年，腫瘤治療研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)之一就是以自噬為靶點(diǎn)的腫瘤治療。

自噬與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其機(jī)制目前還非常復(fù)雜不明。在自噬被抑制時(shí)，由于胞內(nèi)合成底物非常缺乏以及代謝的嚴(yán)重障礙，而使細(xì)胞凋亡發(fā)生；然而當(dāng)胞內(nèi)嚴(yán)重激活自噬時(shí)，由于物質(zhì)的過(guò)度消耗，從而也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。自噬的活化作用使LC3-Ⅰ發(fā)生酯化，從而LC3-Ⅱ型蛋白產(chǎn)生，且其定位于自噬泡，所以LC3蛋白可作為自噬檢測(cè)一種標(biāo)志蛋白。本次研究通過(guò)western blot檢測(cè)結(jié)果表明，檜木醇處理腎癌786-O細(xì)胞后，P62蛋白的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，而P62蛋白是細(xì)胞自噬活動(dòng)的特異性底物之一。本次研究結(jié)果很可能是由于檜木醇引起細(xì)胞自噬被過(guò)度激活，使胞內(nèi)物質(zhì)消耗過(guò)度，從而導(dǎo)致腎癌786-O細(xì)胞凋亡。在本研究中，當(dāng)腎癌細(xì)胞給予3-MA來(lái)進(jìn)行抑制細(xì)胞自噬活動(dòng)后，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，這一結(jié)果更加表明檜木醇對(duì)腎癌細(xì)胞的抗腫瘤作用與自噬作用有密切關(guān)系。

本研究證明了檜木醇在體外水平的抗腎癌作用，且初步發(fā)現(xiàn)其抗癌作用可能與細(xì)胞自噬被過(guò)度激活有關(guān)。

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(編輯：甘艷)

Effect of Hinokitol on Proliferation of RCC 786-O and Related Cytokines

CUILong，ZHAOJuan.

XiangyangCenterHospital，Xiangyang，441021

ObjectiveTo study the hinokitol anti-renal carcinoma effect in vitros，and explore the mechanism.Methods MTT and flow cytometry assay were used to detect the effect of hinokitol on RCC 786-O cell proliferation inhibition and apoptosis；assay hinokitol influence on RCC 786-O cells caspase-3 shear body，LC3 and p62 protein expression were detected by Western blot.To verify the relationship between the anti-cancer effect and autophagy by 3-MA.ResultsHinokitol can significantly inhibit the proliferation of human 786-O cells，induce cell apoptosis by activating Caspase pathway.At the same time hinokitol induced RCC 786-O cell autophagy，leading to LC3 protein expression was significantly up-regulated，while P62 protein expression was down regulated.ConclusionHinokitol can significantly inhibit the proliferation of RCC786-O cells，and excessive activation of autophagy can promote apoptosis of human renal carcinoma cell line.

Renal cell carcinoma；786-O cells；Hinokitol；Autophagy

441021 湖北省襄陽(yáng)市中心醫(yī)院

趙娟

R737.11

A

1001-5930(2016)07-1056-03

2015-08-10

2015-12-21)