廖學(xué)武　羅　丹

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5-Fu聯(lián)合醒腦靜干預(yù)對(duì)絨毛癌致急性腦出血髓鞘相關(guān)抑制因子Ephrin-B3的mRNA及蛋白表達(dá)的影響

廖學(xué)武羅丹

目的探討5-Fu聯(lián)合醒腦靜干預(yù)對(duì)絨毛癌致急性腦出血髓鞘相關(guān)抑制因子Ephrin-B3的mRNA及蛋白表達(dá)的影響。方法選擇原發(fā)性絨毛癌致急性腦出血患者30例為研究對(duì)象，對(duì)照組患者(n=15)進(jìn)行5-氟尿嘧啶(5-Fu)鞘內(nèi)化療，治療組患者(n=15)進(jìn)行5-Fu鞘內(nèi)化療+靜脈滴注醒腦靜注射液，對(duì)2組患者的一般資料(年齡、發(fā)生部位、血β-HCG)、Ephrin-B3的mRNA水平及Ephrin-B3蛋白水平進(jìn)行比較。結(jié)果2組患者的一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。治療后治療組Ephrin-B3的mRNA水平和Ephrin-B3蛋白水平均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論5-Fu聯(lián)合醒腦靜干預(yù)能明顯降低絨毛癌致急性腦出血髓鞘相關(guān)抑制因子Ephrin-B3的mRNA水平和蛋白水平。

醒腦靜；Ephrin-B3；急性腦出血；絨毛癌

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.011

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1078～1080)

醒腦靜由天然麝香、冰片、梔子、郁金精制而成，現(xiàn)代藥理作用研究顯示，其具清除自由基、降低腦脊液中內(nèi)源性致熱原、抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡、減輕腦水腫、改善腦循環(huán)、保護(hù)腦細(xì)胞等作用，對(duì)急性腦出血、中樞性高熱和意識(shí)障礙等具有顯著的治療作用，且毒副作用小[1-4]。EphrinB3是1種與紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞受體相互作用的蛋白，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與大腦防御反應(yīng)、骨髓造血功能調(diào)節(jié)及大部分器官系統(tǒng)的自身平衡[5-6]。絨毛膜癌是1種惡性程度很高的腫瘤，絕大多數(shù)絨毛癌與妊娠有關(guān)，分別繼發(fā)于葡萄胎、流產(chǎn)或正常分娩之后。絨毛膜癌可發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，病情嚴(yán)重會(huì)引起腦出血，危及患者的生命，治療多采用靜脈聯(lián)合化療、鞘內(nèi)化療、放射治療及開(kāi)顱手術(shù)等綜合治療[7-8]。本研究意在探討5-Fu聯(lián)合醒腦靜干預(yù)對(duì)絨毛癌致急性腦出血髓鞘相關(guān)抑制因子Ephrin-B3的mRNA及蛋白表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1臨床資料

選擇2011年4月至2015年5月我院收治的原發(fā)性絨毛癌致急性腦出血患者30例為研究對(duì)象?；颊咂骄挲g(32.5±8.9)歲。所有患者入院時(shí)行顱內(nèi)血腫抽吸，在此基礎(chǔ)上，對(duì)照組患者(n=15)進(jìn)行5-氟尿嘧啶(5-Fu)(0.3 g/次)鞘內(nèi)化療，治療組患者(n=15)進(jìn)行5-Fu鞘內(nèi)化療(0.3 g/次)+靜脈滴注醒腦靜注射液(250 ml 0.9%氯化鈉注射液中含30 ml 10 g/kg醒腦靜注射液)，連續(xù)治療14天后，行血腫穿刺取少許殘血。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)陰道彩色多普勒超聲、組織活檢診斷儀確診為絨毛癌且發(fā)生腦出血的患者；②頭顱CT提示腦出血；③腦出血發(fā)病2周內(nèi)；④出血量在20～40 ml之間。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由高血脂、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、外傷等腦血管的病變引起的腦出血；②伴發(fā)其他癌癥。

1.2方法

所有患者均進(jìn)行B超檢查、組織活檢和頭顱CT檢查及顱血腫抽吸術(shù)。

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Ephrin-B3基因mRNA的水平抽吸患者顱血，分離淋巴細(xì)胞，采用QIAquickRNA Extraction Kit(購(gòu)自QIAGEN公司，德國(guó))抽提淋巴細(xì)胞總RNA。濃度及純度符合要求的RNA進(jìn)行合成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈的合成按照First Strand cDNAsynthesis Kit操作說(shuō)明(Takara公司，日本)，反應(yīng)條件為：42 ℃孵育30 min。合成的cDNA第一鏈放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)Ephrin-B3基因序列，在Oligo7.5軟件上設(shè)計(jì)Ephrin-B3基因熒光定量(qPCR)引物，引物序列為：Ephrin-B3 F：5’-ATGAAGGTGCTTCTGCGAGT；Ephrin-B3 R：5’-CTGTTGGGGTCACCTGGTAT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為105 bp。以ACTIN作為參考基因，引物序列為：ACTIN F：5’-CGACGTAGTC TCATCTGAC TT-3’；ACTIN R：5’-GTTGCAGTCGACATAATCGTTGA-3’，片段長(zhǎng)度為112 bp。引物均由上海生工有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 20 μl，反應(yīng)體系為：cDNA第一鏈1 μl，2xTrans Start Top Green qPCRSuperMix 10 μl，引物1(10 μM)0.6 μl，引物2(10 μM)0.6 μl，Passive Reference Dye 0.4 μl， ddH2O 7.4 μl(試劑購(gòu)于北京全式金有限公司)，反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃10 sec；58 ℃20 sec；72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。同時(shí)進(jìn)行溶解曲線的分析，程序?yàn)椋?0 ℃ 1 min；95 ℃30 s。在ABI7500分析軟件上分析Ephrin-B3及ACTIN基因的Ct值，采用2-△Ct法計(jì)算對(duì)照組和處理組Ephrin-B3的相對(duì)表達(dá)量，采用公式Ct=Ct(Ephrin-B3基因)-Ct(ACTIN基因)。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清Ephrin-B3蛋白水平抽吸患者顱血，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清Ephrin-B3的水平，具體操作按美國(guó)PHOENIX公司Ephrin-B3試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.12組患者一般資料的比較

對(duì)照組和治療組患者的年齡、絨毛膜癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生部位及血清β-HCG水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　2組患者一般資料的比較

2.22組患者Ephrin-B3基因mRNA水平的比較

對(duì)照組EphrinB3 mRNA的水平為(2.68±0.75)，高于治療組EphrinB3 mRNA的水平為(1.05±0.33)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.704，P<0.0001)。

2.32組患者Ephrin-B3蛋白水平的比較

對(duì)照組Ephrin-B3蛋白水平為(233.42±21.41)，高于治療組Ephrin-B3蛋白水平(162.37±33.10)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.980，P<0.0001)。

3　討論

絨毛膜癌是一種惡性程度很高的腫瘤，近年來(lái)應(yīng)用化學(xué)藥物治療，使絨毛癌的預(yù)后有了顯著的改觀。絨毛膜癌可發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，病情嚴(yán)重者可發(fā)生腦出血[9]，治療多采用靜脈聯(lián)合化療、鞘內(nèi)化療、放射治療及開(kāi)顱手術(shù)等綜合治療，但絨毛癌的化療過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)造血功能障礙等副作用，引起白細(xì)胞下降引起的敗血癥和血小板下降引起的出血，包括腦出血。腦出血的發(fā)生會(huì)影響整個(gè)神經(jīng)-大腦-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的正常機(jī)能，降低機(jī)體的抗感染和抗腫瘤能力，情況嚴(yán)重者危及患者的生命[10]。EphrinB3是一種與紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞受體相互作用的蛋白，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與大腦防御反應(yīng)、骨髓造血功能調(diào)節(jié)及大部分器官系統(tǒng)的自身平衡，在腦出血發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中起一定的作用[11]。醒腦靜由天然麝香、冰片、梔子、郁金精制而成，具有清熱解毒，涼血活血，開(kāi)竅醒腦之功效，現(xiàn)代藥理研究顯示醒腦靜能保護(hù)腦出血患者的腦組織，改善腦缺血患者的意識(shí)狀態(tài)，可明顯降低腦出血患者血神經(jīng)肽Y和腦水腫的水平，能有效抑制腦出血患者炎癥細(xì)胞因子的釋放，控制各細(xì)胞因子水平的變化情況，激活體內(nèi)SOD，清除顱內(nèi)氧自由基，抑制炎性因子TNF-α，促進(jìn)造血及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，對(duì)腦出血患者有利[12-14]。而EphrinB3在腦出血發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[15]，鑒于此，本文就醒腦靜對(duì)Ephrin-B3表達(dá)水平的影響進(jìn)行研究。

本研究通過(guò)5-Fu聯(lián)合醒腦靜干預(yù)絨毛癌致急性腦出血患者，研究干預(yù)后髓鞘相關(guān)抑制因子Ephrin-B3的mRNA及蛋白表達(dá)，從Ephrin-B3角度探討醒腦靜在絨毛癌致急性腦出血治療作用的一個(gè)分子機(jī)制。通過(guò)熒光定量PCR，以ACTIN為參考基因，研究Ephrin-B3的mRNA水平，結(jié)果顯示，經(jīng)5-Fu聯(lián)合醒腦靜治療的患者Ephrin-B3的mRNA水平明顯低于僅通過(guò)5-Fu治療的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ephrin-B3蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)5-Fu聯(lián)合醒腦靜治療的患者Ephrin-B3的蛋白水平明顯低于僅通過(guò)5-Fu治療的患者Ephrin-B3的蛋白水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明醒腦靜能降低絨毛癌致急性腦出血患者Ephrin-B3的mRNA水平和蛋白水平，可能為醒腦靜治療絨毛癌致急性腦出血的分子機(jī)制。在絨毛癌致急性腦出血患者中，多數(shù)患者主要為腦白質(zhì)區(qū)的出血，據(jù)研究報(bào)道[16]，Ephrin-B3作為一種髓鞘相關(guān)抑制因子，與腦白質(zhì)的損傷有關(guān)，腦白質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中起著傳遞信息，分泌和支撐神經(jīng)元、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)纖維等作用，其腦白質(zhì)損傷對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生不利的影響，引起神經(jīng)纖維的斷裂、變性甚至壞死，表明Ephrin-B3水平的降低在腦出血發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中起一定的作用。

綜上所述，醒腦靜能降低絨毛癌致急性腦出血患者Ephrin-B3的水平，這可能是醒腦靜在絨毛癌致急性腦出血患者中起治療作用的一個(gè)分子機(jī)制，然而其具體的機(jī)制和通路仍有待進(jìn)一步研究。

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(編輯：甘艷)

Effect of 5-Fu combined with Xingnaojing Intervention on Ephrin-B3 mRNA and ItsProtein Expression in Patients with Acute Cerebral Hemorrhage Induced byChoriocarcinoma

LIAOXuewu，LUODan.

People'sHospitalofDazuDistrict，Chongqing，402360

ObjectiveTo study the effects of 5-Fu combined with Xingnaojing intervention on Ephrin-B3 mRNA and its protein expression in patients with acute cerebral hemorrhage induced by choriocarcinoma.Methods30 female patients with primary intracranial brain metastases from choriocarcinoma were selected.The control group (n=15)were treated with 5-fluorouracil (5-Fu) sheath.The treatment group (n=15)were treated with 5-Fu combined with Xingnaojing intravenously.The clinical features (age，location，serum β-HCG)，mRNA and protein levels of Ephrin-B3 of the 2 groups were compared.ResultsGeneral information in the 2 groups showed no significant difference(P>0.05)，while mRNA and protein levels of Ephrin-B3 in the treatment group were lower than the control group，there had statistically significant difference (P<0.05).ConclusionThe intervention of 5-Fu combined with Xingnaojing can significantly reduce the mRNA and protein levels of Ephrin-B3 in patients with acute cerebral hemorrhage induced by choriocarcinoma.

Xingnaojing；Ephrin-B3；Acute cerebral hemorrhage；Choriocarcinoma

402360 重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院

羅丹

R730.5

A

1001-5930(2016)07-1078-03

2015-09-07

2015-12-21)