羅愛華，豐大利，付娟，李欣

（三峽大學第二人民醫(yī)院暨宜昌市第二人民醫(yī)院 腫瘤放化療科，湖北 三峽 443000）

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Ⅰ，Ⅱ期宮頸癌組織HIF-1α與COX-2蛋白共表達對預(yù)后的影響及機制*

羅愛華，豐大利，付娟，李欣

（三峽大學第二人民醫(yī)院暨宜昌市第二人民醫(yī)院 腫瘤放化療科，湖北 三峽 443000）

目的探討Ⅰ，Ⅱ期宮頸癌組織中HIF-1α與COX-2蛋白的共表達對預(yù)后的影響及可能的機制。方法免疫組織化學法分析71例宮頸癌標本的HIF-1α和COX-2的共表達情況；RT-PCR法檢測標本中HIF-1α mRNA和COX-2 mRNA的表達水平。χ2檢驗分析不同表達組患者1、2和3年存活率的差異；采用KM生存分析法了解不同表達組患者的存活時間的差異；采用相關(guān)分析了解蛋白及mRNA表達水平的相關(guān)性。結(jié)果HIF-1α和COX-2共表達組患者的3年存活率低于非共表達組（P＜0.05）；HIF-1α和COX-2共表達組患者的存活時間低于非共表達組（P＜0.05）；在Ⅱ期患者中，HIF-1α的蛋白水平與COX-2 mRNA的水平正相關(guān)（rs=0.594，P＜0.05）。結(jié)論在Ⅰ，Ⅱ期宮頸癌中，HIF-1α和COX-2共表達組預(yù)后較差；HIF-1α蛋白可能正向調(diào)控COX-2 mRNA的表達。

宮頸癌；缺氧誘導(dǎo)因子1α；環(huán)氧合酶2；共表達；生存分析

缺氧是實體腫瘤形成的重要因素之一，在腫瘤形成時會造成正常血管壓迫或阻塞導(dǎo)致缺氧環(huán)境加重，但在缺氧微環(huán)境下惡性腫瘤仍可不斷生長、浸潤甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移，說明腫瘤細胞對缺氧具有很強的適應(yīng)能力。缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是1992年SEMENZA與WANG在低氧的肝癌細胞株Hep3 B細胞的核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，由兩個亞基組成的異二聚體：HIF-1α和HIF-1β，都具有二聚化所需的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）和PAS（PERARNT-SIM）結(jié)構(gòu)域［1］。缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）既是HIF-1活性的調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的一個特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子。已在多種惡性腫瘤及癌前病變中檢測到HIF-1α蛋白的過度表達，但正常組織及良性病變中則無表達。環(huán)氧合酶（Cyclooxygenase，COX，）是分解花生四烯酸（arachidonic acid，AA），生成各種內(nèi)源性前列腺素（Prostaglandins，PGs）過程中重要的限速酶。目前，人們認為COX至少有3種形式：COX-1，COX-2，COX-3［2］。COX-2屬于反應(yīng)基因，在靜止細胞中不易被檢測到。COX-2呈誘導(dǎo)性表達，在大多數(shù)正常組織中表達極少，而當細胞接受各種刺激如細胞因子、生長因子、癌基因及促腫瘤劑的誘導(dǎo)后表達上調(diào)，參與炎癥及腫瘤的發(fā)生［3-5］。包括結(jié)腸癌［6］，肝癌［7-8］，胰腺癌［9］在內(nèi)的多種腫瘤組織均發(fā)現(xiàn)有COX-2的高表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本實驗采用免疫組織化學及RT-PCR方法檢測HIF-1α和COX-2的蛋白和mRNA表達水平。按蛋白表達情況分組，探討HIF-1α和COX-2共表達及非共表達組的生存率及生存時間的差異。探討HIF-1α蛋白水平和COX-2 mRNA水平的相關(guān)性，或COX-2蛋白水平和HIF-1αmRNA水平的相關(guān)性，明確HIF-1α和COX-2可能存在的調(diào)節(jié)關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選取2003年9月～2012年2月確診并行手術(shù)治療的71例宮頸癌標本。所有病例臨床資料完整，患者年齡23～77歲，平均年齡46.3歲。所有患者術(shù)前均未行放化療，術(shù)后病理類型均為鱗癌，分期為Ⅰb～Ⅱb期。術(shù)后行放療或放化療。

1.2HIF-1α和COX-2免疫組織化學檢測

1.2.1實驗方法及步驟固定后洗滌、脫水、透明浸蠟包埋，5μm切片，60度30 min脫蠟2次。水化后抗原修復(fù)、阻斷、封閉。然后加一抗，HIF-1α多克隆抗體濃度為1∶400、COX-2多克隆抗體濃度為1∶150，上述一抗均購自Abcam公司。4℃過夜，再加HRP標記二抗40 min；DAB染色3～10 min，蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察。

1.2.2免疫組織化學結(jié)果判定采用病理圖像系統(tǒng)分析每張切片隨機取3個高倍視野（10×20），HIF-1α按細胞核或細胞漿呈棕黃色染色為陽性；COX-2以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。免疫組織化學染色指數(shù)為染色面積與染色強度的乘積。

1.3RT-PCR檢測宮頸癌組織HIF-1αmRNA與COX-2 mRNA的表達情況

Trizol試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度（A260/250＞1.8）。取總RNA 5μg，按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑說明完成cDNA的合成。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃、15 s、60℃、45 s循環(huán)40次。取2μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析，ABI Prism 7500 SDS Software。見表1。

表1　擴增引物序列表

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用χ2檢驗，計量資料采用相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier統(tǒng)計學分析及COX回歸分析。

2　結(jié)果

2.1免疫組織化學結(jié)果

HIF-1α陽性表達的宮頸癌標本細胞成團分布，細胞質(zhì)濃染，呈棕黃色染色，見圖1。71例宮頸癌組織中41例HIF-1α陽性，陽性率57.8%。COX-2陽性表達的宮頸癌標本細胞成團分布，細胞質(zhì)濃染，呈棕黃色染色，見圖2。71例宮頸癌組織中53例COX-2陽性，陽性率74.6%。71例宮頸癌組織中HIF-1α與COX-2共表達33例，共表達率46.5%。

2.2HIF-1α和COX-2共表達對生存率的影響

根據(jù)HIF-1α和COX-2的表達情況分為4組：1組，HIF-1α 陰性，COX-2陰性組；2組，HIF-1α陰性，COX-2陽性組；3組，HIF-1α陽性，COX-2陰性組；4組，HIF-1α陽性，COX-2陽性組。各組的存活率見表2，經(jīng)χ2檢驗各組3年存活率有顯著性差異，P＜0.05。經(jīng)行×列χ2分割分析，HIF-1α和COX-2共表達組即4組的3年存活率顯著低于另外3組，Pearsonχ2=7.289，P=0.007；而非共表達的3組間3年存活率差異無統(tǒng)計學意義。

2.3生存時間的影響因素

根據(jù)HIF-1α和COX-2的表達情況分為4組：1組，HIF-1α陰性，COX-2陰性組；2組，HIF-1α陰性，COX-2陽性組；3組，HIF-1α陽性，COX-2陰性組；4組，HIF-1α陽性，COX-2陽性組。以上4組K-M生存曲線見圖3，Breslowχ2=9.845，P=0.02，提示按免疫組織化學不同分組的生存分布差異有統(tǒng)計學意義。按患者年齡分組，以45歲為劃分標準，按年齡＜45歲組與齡≥45歲組對生存生存時間的影響，做Kaplan-Meier統(tǒng)計學分析，Breslowχ2=0.027，P=0.870，提示不同年齡分組的生存分布差異無統(tǒng)計學意義。按患者臨床分期進行Kaplan-Meier統(tǒng)計學分析，了解臨床分期對患者生存時間的影響，Breslow χ2=8.482，P=0.014，提示不同臨床分期的生存分布差異有統(tǒng)計學意義。采用COX回歸模型分析影響患者生存分布的危險因素。多因素回歸分析提示患者臨床分期及HIF-1α和COX-2免疫組織化學表達情況分別是獨立的預(yù)后因素，見表3。

2.4HIF-1α和COX-2 mRNA的表達情況

HIF-1αmRNA和COX-2 mRNA的擴增動力曲線見圖4。COX-2 mRNA在宮頸癌組織中的表達水平與分期有關(guān)，Ⅱ期宮頸癌組織的表達水平顯著高于Ⅰ期宮頸癌患者。

2.5HIF-1α蛋白水平和COX-2 mRNA表達的相關(guān)性

免疫組織化學指數(shù)反映蛋白的表達水平，mRNA含量反應(yīng)了mRNA的表達水平。在Ⅱ期宮頸癌中，HIF-1α蛋白水平和COX-2 mRNA的表達水平呈顯著正相關(guān)，r=0.594，P＜0.05。而在Ⅰ期宮頸癌組織中兩者相關(guān)性不明顯?？赡芘cⅡ期宮頸癌組織乏氧狀況更明顯有關(guān)。

圖1　HIF-1α陽性表達情況 （SP×200）

圖2　COX-2陽性表達情況 （SP×200）

表2　各組存活率的比較

表3　COX模型篩選的危險因素及參數(shù)估計

圖3　不同免疫組織化學分組的Kapplan-meire生存曲線

圖4　mRNA擴增動力曲線

3　討論

惡性實體腫瘤由于增長迅速，經(jīng)常會常出現(xiàn)缺氧的微環(huán)境，缺氧是惡性腫瘤治療效果差，容易出現(xiàn)放化療耐受性的常見原因之一。CHOI等［10］認為在腫瘤發(fā)生早期即可發(fā)生HIF-1的過度表達，并且HIF-1的過度表達與腫瘤血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。正常氧分壓下，細胞內(nèi)HIF-1α不穩(wěn)定，經(jīng)泛素一蛋白酶體等途徑迅速降解。缺氧時，胞質(zhì)中HIF-1α穩(wěn)定性增加，降解受阻，積聚增多并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，與核內(nèi)的HIF-β結(jié)合成二聚體，形成有活性的HIF-1，繼而與缺氧反應(yīng)基因結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄過程，引起一系列的細胞對缺氧的反應(yīng)［11］。迄今為止，確定的受HIF-1調(diào)控的缺氧反應(yīng)基因有70多種［12］。該產(chǎn)物涉及參與腫瘤細胞的能量代謝、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、耐藥及血管擴張、血管新生等多個方面。COX-2屬于反應(yīng)基因，在靜止細胞中不易被檢測到。COX-2在上皮組織癌（包括胃癌、直結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤等）中普遍存在過度表達現(xiàn)象，并影響患者的預(yù)后［13］。COX-2介導(dǎo)的生物學效應(yīng)涉及腫瘤血管新生、細胞的增殖和凋亡、促進腫瘤細胞遷移，細胞黏附和腫瘤侵襲等。有資料顯示HIF-1α，COX-2表達情況與患者預(yù)后有關(guān)。本實驗資料顯示，HIF-1α和COX-2共表達組的1年，2年，3年存活率均低于非共表達組；HIF-1 α和COX-2共表達組的存活時間顯著低于非共表達組，并且HIF-1α和COX-2共表達可以作為一個獨立的預(yù)后因素。兩者共表達預(yù)后較差，可能與兩者共同促進腫瘤的惡性行為有關(guān)。

對于HIF-1α和COX-2的關(guān)系，STASINOPOULOS等［14］認為COX-2可通過其催化產(chǎn)物PGE2激活HIF-1α活性以促進腫瘤血管生成。TAMMALI等［15］提出COX-2/PGE2/HIF-1α/VEGF途徑可能是COX-2促進腫瘤血管生成的又一條途徑。LIM等［16］通過研究發(fā)現(xiàn)，COX-2選擇性抑制劑NS398通過COX-2/PGE2途徑抑制HIF-1αmRNA的表達，減少HIF-1α的合成，從而抑制缺氧誘導(dǎo)的血管生成。JUNG等［17］的研究顯示，HIF-1是關(guān)聯(lián)炎癥和癌變過程的一個重要轉(zhuǎn)錄因子，IL-1誘導(dǎo)活化NFKB/COX-2途徑，上調(diào)HIF-1α蛋白的表達，并最終上調(diào)VEGF的表達，促進腫瘤血管生成。STASINOPOULOS等［14］發(fā)現(xiàn)PGE-2可以增強絲裂原活化激酶（MAPK）的活性，從而加速HIF-1α翻譯轉(zhuǎn)錄和在核內(nèi)的積聚。上述研究均表明，COX-2可調(diào)控HIF-1α蛋白的表達。但也有學者持不同意見，認為COX-2是HIF-1α下游的靶基因之一，受缺氧的誘導(dǎo)活化［18］。CSIKI等［19］的最新的研究通過對缺氧反應(yīng)基因序列的比較，COX-2啟動子缺失分析和定向誘變，證實在COX-2啟動子內(nèi)存在缺氧反應(yīng)元件（hypoxia-responsive element，HRE），通過其與HIF-1α的結(jié)合，激活肺癌細胞中COX-2的表達。本組資料顯示，HIF-1α和COX-2 mRNA的表達呈正相關(guān)（rs=0.594，P＜0.05），因此可以推斷，COX-2 mRNA的表達受HIF-1α水平的調(diào)控。HIF-1α可能通過與COX-2啟動子內(nèi)存在缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，促進COX-2的轉(zhuǎn)錄。從而認為COX-2是HIF-1α下游的靶基因之一。HIF-1α蛋白可能正向調(diào)控COX-2 mRNA的表達。

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（張蕾編輯）

Influence of the coexpression of HIF-1α and COX-2 on prognosis of patients with cervical cancer in stageⅠand stageⅡand possible functional mechanism*

Ai-hua Luo，Da-li Feng，Juan Fu，Xin Li
（Department of Chemo-irradiation Oncology，Yichang Second People's Hospital，Yichang，Hubei 443000，China）

Objective To investigate the influence of the coexpression ofHIF-1αandCOX-2on the prognosis of patients with cervical cancer in stageⅠ and stageⅡ and the possible functional mechanism.Methods The coexpressions ofHIF-1αandCOX-2were detected in 71 cases with cervical cancer by immunohistochemical.The levels ofHIF-1αmRNA andCOX-2mRNA were detected by RT-PCR.Chi-squared test was used to analyze the differences of survival rate from one year to three year in different groups；KM survival analysis was used for the survival time in different groups；correlation analysis was used to analyze the correlation between protein and mRNA level.Results The survival rate of three year in the group of coexpression ofHIF-1αandCOX-2was significantly lower than that in the non-coexpression group（P＜0.05）.The survival time in the group of coexpression ofHIF-1α andCOX-2was significantly shorter than that in the non-coexpression group（P＜0.05）.There was a positive correlation between theHIF-1αprotein level and theCOX-2mRNA level in the patients with cervical cancer in stageⅡ（rs=0.594，P＜0.05）.Conclusions The prognosis is poorer in the group of coexpression ofHIF-1αand COX-2of patients with cervical cancer in stageⅠ and stageⅡ than the non-coexpression group.TheHIF-1αprotein may upregulate the level ofCOX-2mRNA.

cervical cancer；HIF-1α；COX-2；coexpression；survival analysis

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.014

1005-8982（2016）16-0067-05

2016-04-14

宜昌市醫(yī)療衛(wèi)生科研項目（No：A14301-31）［通信作者］李欣，E-mail：lixinyc5189@163.com