張俊濤，劉志貞，劉　丹，張悅紅

?

高糖對神經(jīng)干細胞凋亡的影響

張俊濤，劉志貞，劉丹，張悅紅

目的探討高糖環(huán)境是否可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞凋亡。方法從C57大鼠海馬組織提取培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，分為3組：正常對照組、低糖組(5 mmol/L)、高糖組(50 mmol/L)，不同濃度葡萄糖作用48 h后，運用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 梯狀條帶、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞具有形成神經(jīng)球的能力，Nestin免疫熒光染色呈陽性反應(yīng)，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。瓊脂糖凝膠電泳顯示高糖組提取的DNA出現(xiàn)特征性梯狀條帶，正常對照組和低糖組未出現(xiàn)。流式細胞術(shù)檢測正常對照組細胞凋亡率(5.83±0.36)%，低糖組細胞凋亡率(6.25±0.52)%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高糖組細胞凋亡率(20.97±1.21)%，與正常對照組和低糖組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞凋亡。

神經(jīng)干細胞；細胞凋亡；高糖；瓊脂糖凝膠電泳；Nestin免疫熒光染色

糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或作用障礙所致的以血糖增高為特征的代謝性疾病，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致病人出現(xiàn)認知功能障礙和癡呆等疾病[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人海馬組織可出現(xiàn)嚴重萎縮，并且萎縮程度與糖尿病病程相關(guān)；同時基礎(chǔ)實驗證實在糖尿病大鼠模型海馬組織中發(fā)現(xiàn)大量凋亡的神經(jīng)元細胞[2]，表明高糖環(huán)境引起的神經(jīng)細胞凋亡在糖尿病病人中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮重要作用。

神經(jīng)干細胞是神經(jīng)組織特異性的具有無限自我復(fù)制與更新和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞能力的干細胞[3]。研究發(fā)現(xiàn)：成年哺乳動物腦組織的海馬齒狀回和側(cè)腦室下層也存在神經(jīng)干細胞，并且可以分化為神經(jīng)前體細胞、神經(jīng)元及各類神經(jīng)膠質(zhì)細胞[4]，但是由于成年哺乳動物腦組織中神經(jīng)干細胞數(shù)量有限，機體自身神經(jīng)干細胞對神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的效果并不明顯。隨著生物治療技術(shù)的開展，國內(nèi)外學(xué)者探索神經(jīng)干細胞顱內(nèi)移植治療各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，為傳統(tǒng)方法治療難以取得效果的疾病帶來希望。

糖尿病高糖環(huán)境下神經(jīng)干細胞是否也會發(fā)生凋亡，影響神經(jīng)干細胞在高血糖病人腦內(nèi)存活率，降低神經(jīng)干細胞損傷修復(fù)的治療效果。本實驗擬通過高糖環(huán)境培養(yǎng)海馬組織神經(jīng)干細胞，運用DNA ladder檢測凋亡小體，Annexin V/PI染色觀察神經(jīng)干細胞凋亡率，研究高糖環(huán)境對神經(jīng)干細胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料葡萄糖購于Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、B27 購自Gibco公司，EGF、bFGF購自PeproTech公司，Nestin、NF-H、GFAP、GALC兔抗小鼠多克隆抗體購于SANTA CRUZ公司，F(xiàn)ITC標記羊抗兔二抗、Cy3標記羊抗兔二抗購于Invitrogen公司，DNA ladder檢測試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及鑒定

1.2.1神經(jīng)干細胞培養(yǎng)取成年C57小鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)大腦組織分離海馬區(qū)域，采用機械消化法，反復(fù)吹打海馬組織直到呈單細胞懸液，收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清，神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液重懸，通過細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，轉(zhuǎn)移至50 mL細胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。

1.2.2神經(jīng)干細胞鑒定將神經(jīng)干細胞球吸出轉(zhuǎn)移至6孔板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)2 h；0.01 mol/L PBS洗3次，4%多聚甲醛固定；0.1%Triton破膜；2%山羊血清封閉；0.01 mol/L PBS洗3次，加入兔抗Nestin多克隆抗體，4 ℃過夜；0.01 mol/L PBS洗3次，加入羊抗兔IgG-Cy3二抗，避光作用2 h；抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3神經(jīng)干細胞分化與鑒定將神經(jīng)干細胞球吸出轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入神經(jīng)干細胞分化液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)1周，0.01 mol/L PBS洗3次，4%多聚甲醛固定；0.1%Triton破膜；2%山羊血清封閉；0.01 mol/L PBS洗3次，分別加入小鼠抗NF-H多克隆抗體、兔抗GFAP多克隆抗體、兔抗GALC多克隆抗體，4 ℃過夜；0.01 mol/L PBS洗3次，各孔中分別加入相應(yīng)熒光二抗：羊抗兔FITC標記二抗或Cy3標記羊抗兔二抗，避光作用2 h；抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3實驗分組神經(jīng)干細胞經(jīng)鑒定后傳代至六孔板37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h用于實驗，觀察高糖環(huán)境對海馬神經(jīng)干細胞的影響，實驗分為3組：正常對照組、低糖組(5 mmol/L)、高糖組(50 mmol/L)，各組加入葡萄糖后再放入培養(yǎng)箱作用48 h。

1.4DNA梯狀條帶凝膠電泳檢測離心(800 r/min，5 min)收獲各組細胞，0.01 mol/L PBS洗3次，將細胞沉淀重懸于400 μL細胞裂解液中，離心去上清液，加入RNase、蛋白酶K，酚/氯仿抽提DNA，20 μL TE溶解，1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外線下照相，伯樂凝膠成像系統(tǒng)進行灰度值分析。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡離心(800 r/min，5 min)獲取各組細胞，0.01 mol/L PBS洗3次，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至106/mL，取100 μL細胞懸液加入5 mL流式管中，分別加入5 μL Annexin V/FITC(20 μg/mL)、10 μL PI(10 μg/mL)液，避光作用15 min，再加入400 μL結(jié)合緩沖液，流式細胞儀檢測，結(jié)果用隨機軟件分析。

2　結(jié)　果

2.1神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)C57小鼠海馬源性神經(jīng)干細胞(見圖1A)個體小而且呈透明圓形，懸浮生長。培養(yǎng)1周，可見神經(jīng)干細胞球形成，隨球體增大，位于球體中心的干細胞因營養(yǎng)成分攝取不足出現(xiàn)一定程度壞死，呈現(xiàn)黑色斑塊(見圖1B)。經(jīng)傳代后的神經(jīng)干細胞可增殖再次聚集形成細胞球，球體形態(tài)規(guī)則，折光性好。Nestin免疫熒光染色神經(jīng)干細胞球呈陽性反應(yīng)(見圖1C)。對加入神經(jīng)干細胞分化液后呈貼壁狀態(tài)生長的細胞進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示海馬源性神經(jīng)干細胞可以分化為神經(jīng)元(見圖1D)、星形膠質(zhì)細胞(見圖1E)和少突膠質(zhì)細胞(見圖1F)。

圖1　神經(jīng)干細胞及鑒定

2.2DNA梯狀條帶凝膠電泳檢測實驗結(jié)果顯示經(jīng)高糖(50 mmol/L)處理的神經(jīng)干細胞，其細胞提取的DNA中呈現(xiàn)典型的細胞凋亡梯狀條帶，而正常對照組和低糖組(5 mmol/L)提取的DNA中未出現(xiàn)梯狀條帶(見圖2)，實驗證明高糖環(huán)境可誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡。

2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡經(jīng)流式細胞儀檢測，正常對照組和低糖組(5 mmol/L)中有少量神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡(見圖3A、圖3B)，正常對照組為(5.83±0.36)%，低糖組為(6.25±0.52)%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高糖組(50 mmol/L)神經(jīng)干細胞凋亡率明顯增加(見圖3C)，達到(20.97±1.21)%，分別與正常組和低糖組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：M為 DNA Maker；H為高糖組(50 mmol/L)；L為低糖組(5 mmol/L)； C為正常對照組。

圖3　流式細胞術(shù)測定各組細胞凋亡流式圖

3　討　論

神經(jīng)干細胞具有自我更新和多向分化潛能，可對機體神經(jīng)損傷部位進行再生修復(fù)，同時神經(jīng)干細胞具有遷移作用和極好的組織相容性[5]。經(jīng)靜脈輸入的外源性神經(jīng)干細胞可優(yōu)先遷移至機體神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位，發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)組織的作用，因為神經(jīng)干細胞屬于未分化細胞，其免疫原性低，移植后很少發(fā)生排異反應(yīng)，有利于移植細胞的存活[6]。以上特點促使神經(jīng)干細胞成為生物治療研究領(lǐng)域的熱點，在移植治療腦出血、腦缺血、中樞神經(jīng)創(chuàng)傷及退變性腦病等研究中，對疾病動物模型的治療取得良好效果。糖尿病是導(dǎo)致老年認知障礙和癡呆的高危因素，可以引起海馬神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡。在高糖環(huán)境下使用神經(jīng)干細胞對老年認知障礙等疾病進行治療，可能會誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡從而影響其修復(fù)能力。

凋亡是細胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，引發(fā)的自主有序的死亡現(xiàn)象。引發(fā)細胞凋亡的原因有生理性或病理性多種因素。在早期可通過檢測細胞外膜是否含有磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)來確定凋亡的發(fā)生。正常細胞的PS存在于細胞膜內(nèi)側(cè)，當細胞發(fā)生凋亡時，PS可從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜外表面，暴露于細胞外環(huán)境中。Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與PS特異性結(jié)合。將Annexin V進行熒光標記作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。在細胞凋亡晚期，DNA在核小體連接處被核酸酶切斷，可產(chǎn)生200 bp的整數(shù)倍大小的DNA碎片，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可呈現(xiàn)出凋亡細胞特征性的梯狀條帶[7]。本實驗通過模擬糖尿病時機體的內(nèi)環(huán)境，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下神經(jīng)干細胞提取的DNA中出現(xiàn)碎片呈現(xiàn)特征性的梯狀條帶，同時流式細胞儀檢測也發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡的比率明顯增多，證實高糖可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡，提示在對糖尿病病人進行神經(jīng)干細胞移植治療時，首先需要控制病人的血糖水平，然后再進行神經(jīng)干細胞移植，這樣才能保證神經(jīng)干細胞移植的成功率，確保最終治療效果。

總之，本實驗通過建立高糖環(huán)境對鼠海馬源性神經(jīng)干細胞刺激的模型，模仿并證實糖尿病病人大腦海馬區(qū)損傷后，機體調(diào)動內(nèi)源性神經(jīng)干細胞或移植外源性神經(jīng)干細胞時，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡，不利于對損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行修復(fù)。但高糖是通過何種機制誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡，還需進一步研究探討。

[1]李梅，馬蘭，李靜，等.胰島素在糖尿病認知障礙發(fā)病中的作用 [J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2013，11(3)：353-355.

[2]肖復(fù)茜，李洪秀，隋海娟，等.知母皂苷元對高糖引起的體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護作用 [J].中國藥理學(xué)通報，2013，29(1)：107-112.

[3]Angel R，Maldonado S，Derek H，et al.Stem cells in the nervous system [J].Am J Phys Med Rehabil，2014，93(1103)：S132-S144.

[4]Ma DK，Ming GL，Song HJ.Glial influences on neural stem cell development：cellular niches for adult neurogenesis [J].Current Opinion in Neurobiology，2015，15(5)：514-520.

[5] Zheng T， Gregory MI，Chen KA，et al.Transplantation of neural stem/progenitor cells into developing and adult CNS [J].Methods in Molecular Biology，2009，482：185-197.

[6]Odeberg J，Piao JH，Samuelsson EB，et al.Low immunogenicity of in vitro-expanded human neural cells despite high MHC expression [J].Journal of Neuroimmunology，2005，161 (1-2)：1-11.

[7]高超，華子春.細胞凋亡檢測方法新進展 [J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2011，33(5)：564-569.

(本文編輯郭懷印)

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目資助(No.81300487)；山西醫(yī)科大學(xué)校青年基金項目資助(No.02201401)

山西醫(yī)科大學(xué)(太原 030001)，E-mail：zhangjuntao4435@sohu.com

R587.1R255.4

Adoi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．14．014

1672-1349(2016)14-1610-04

2016-03-01)