劉娜，董曉莉，葉俊麗，姜忠信

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院，青島266003；2 香港理工大學(xué)深圳研究院；3 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

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細胞自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對小鼠小膠質(zhì)細胞線粒體ROS表達及炎性細胞因子分泌水平的影響

劉娜1，董曉莉2，葉俊麗3，姜忠信1

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院，青島266003；2 香港理工大學(xué)深圳研究院；3 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的觀察細胞自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(RAPA)對脂多糖(LPS)激活的小鼠小膠質(zhì)細胞線粒體ROS表達及腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1β( IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)等炎性細胞因子分泌水平的影響。方法小鼠小膠質(zhì)細胞分為A、B、C組，分別加入100 ng/mL LPS+10 nmol/L RAPA 、100 ng/mL LPS、等量細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。采用MitoSOX RED熒光染色測定各組線粒體ROS水平采用ELISA法檢測各組細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12水平。結(jié)果A、B、C組細胞線粒體ROS水平(RFU值)分別為36.417±3.456、74.939±1.906、14.784±0.898。組間兩兩比較，P<0.05。B組細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6 及 IL-12水平均高于C組(P均<0.05)。A組細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6 及 IL-12水平均低于B組(P均<0.05)。結(jié)論RAPA可降低LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞線粒體ROS表達及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎性細胞因子的分泌水平。

細胞自噬；自噬誘導(dǎo)劑；雷帕霉素；小膠質(zhì)細胞；炎性細胞因子；線粒體；活性氧簇

小膠質(zhì)細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的一種，其適度活化對神經(jīng)突觸的發(fā)生、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的維持及調(diào)節(jié)血腦屏障的完整性具有重要作用。但過度激活的小膠質(zhì)細胞可釋放炎性細胞因子[腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)]及細胞毒性介質(zhì)[活性氧簇(ROS)]，導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生損傷。線粒體是神經(jīng)細胞能量代謝的主要場所，易受ROS損傷。線粒體自噬功能障礙可導(dǎo)致過量ROS產(chǎn)生，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞的急慢性損傷及凋亡[1,2]。2014年10月～2015年12月，本研究觀察了自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(RAPA)對脂多糖(LPS)激活的小膠質(zhì)細胞線粒體ROS表達及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎性細胞因子分泌水平的影響。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1細胞、藥物、材料及試劑小鼠小膠質(zhì)細胞BV-2由昆明動物研究所提供。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、RAPA、LPS均購于美國Sigma公司，線粒體紅色熒光探針、線粒體綠色熒光探針、購自美國Invitrogen公司,含200 mg/L 的L-精氨酸培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、其他組織培養(yǎng)試劑均購自美國Gibco公司。倒置顯微鏡(日本Olympus公司),MR700型酶標(biāo)儀(美國Becton dickinson公司)。

1.2BV-2細胞培養(yǎng)、分組及RAPA用藥方法取對數(shù)生長期的BV-2細胞，置于含15%熱滅活FBS的DMEM培養(yǎng)液中，，5% CO2、37 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)，細胞生長至密度達80%左右時傳代。將細胞分為A、B、C組，分別加入100 ng/mL LPS+10 nmol/L RAPA 、100 ng/mL LPS、等量細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h備用。

1.3各組細胞線粒體ROS測定采用MitoSOX RED熒光染色法測定各組線粒體ROS水平。取培養(yǎng)24 h時對數(shù)生長期各組細胞，接種于96孔板中，每組9個復(fù)孔，PBS洗2 次，按照線粒體ROS檢測說明書加入5 μL MitoSOX RED，37 ℃避光孵育10 min。PBS洗滌細胞3 次，采用流式細胞儀檢測各組細胞平均熒光強度(RFU)，以RFU代表細胞線粒體ROS水平，RFU值大說明細胞線粒體ROS水平高。采用Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4各組細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12檢測取對數(shù)生長期各組細胞，接種于預(yù)敷抗-TNF-α、抗-IL-1β、抗-IL-6和抗-IL-12抗體的96孔板中，PBS沖洗，加入酶標(biāo)多克隆抗體孵育2 h。沖洗4次，加顯色劑孵育30 min，終止液終止反應(yīng)。所有操作均嚴(yán)格按照使用說明書進行，采用酶標(biāo)儀檢測各組細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12在450 nm波長處的吸光度值。 參照試劑盒說明書，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各組TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12的分泌量。

2　結(jié)果

2.1各組細胞線粒體ROS表達比較A、B、C組細胞線粒體ROS(RFU值)分別為36.417±3.456、74.939±1.906、14.784±0.898，組間兩兩比較，P均<0.05。

2.2各組細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12水平比較各組細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12水平比較見表1。

表1　各組細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-12水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

3　討論

當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化時,小膠質(zhì)細胞可迅速被激活，吞噬入侵的病原體和受損細胞的殘骸，清除有毒代謝產(chǎn)物其活化時刺激分泌的TGF-β、IL-10、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等抗炎因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子均可提高神經(jīng)元的防御和修復(fù)能力[3]。但過度持續(xù)激活的小膠質(zhì)細胞可產(chǎn)生多種免疫效應(yīng)分子，如ROS、活性氮(RNS)、促炎細胞因子及蛋白酶等是神經(jīng)元損傷的重要媒介[4]。自噬是近年來發(fā)現(xiàn)的細胞內(nèi)清除損傷、衰老細胞器以及冗余蛋白的一種重要生理過程，營養(yǎng)和能量缺乏、氧化應(yīng)激、感染以及蛋白質(zhì)大量聚集等因素都可以誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬。為了避免細胞損傷，細胞內(nèi)的自噬活動可選擇性地清除受損的線粒體等細胞器，對哺乳動物細胞的線粒體質(zhì)量控制發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[5,6]。線粒體自噬功能障礙導(dǎo)可能致過量ROS產(chǎn)生，參與神經(jīng)細胞的損傷[7,8]。

研究表明，ROS作為胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化、增殖死亡的重要信號分子，是小膠質(zhì)細胞過度活化的重要介質(zhì)，其來源主要來自于小膠質(zhì)細胞呼吸爆發(fā)時活化的NADPH氧化酶[9]。線粒體是細胞內(nèi)ROS的另一重要來源，在小膠質(zhì)細胞從靜止?fàn)顟B(tài)到激活的過程中，細胞內(nèi)mRNA、蛋白表達水平及細胞形態(tài)表型等轉(zhuǎn)變都需要充足的能量供應(yīng)，而線粒體是ATP 生成的主要場所，因此小膠質(zhì)細胞的活化與線粒體密切相關(guān)。線粒體在消耗氧制造ATP的同時必然伴發(fā)有ROS的生成，因此小膠質(zhì)細胞活化時對線粒體高代謝的需求有可能產(chǎn)生高水平的ROS，線粒體中的ROS也可能參與小膠質(zhì)細胞的過度活化。最近，Schwarz等[10]研究已證實，LPS介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化過程中伴有線粒體ROS的大量產(chǎn)生；特異性抑制劑Mito-TEMPO可顯著降低線粒體ROS及胞質(zhì)內(nèi)ROS的產(chǎn)生，抑制LPS介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化及炎癥反應(yīng)，提示了線粒體ROS在小膠質(zhì)細胞異?；罨械闹匾{(diào)控作用。本研究利用可透過線粒體膜結(jié)構(gòu)被超氧陰離子氧化的特異性熒光染料MitoSOX RED作為線粒體ROS指示劑，通過流式細胞術(shù)檢測MitoSOX RED也發(fā)現(xiàn)，LPS單獨處理可顯著提高小膠質(zhì)細胞線粒體中ROS水平，提示了線粒體ROS在小膠質(zhì)細胞活化中重要的調(diào)控作用。

線粒體是易受ROS攻擊的主要靶細胞器，同時衰老損傷的線粒體可進一步產(chǎn)生ROS。在真核細胞中，自噬是真降解和回收利用細胞內(nèi)生物大分子和受損細胞器的重要生理過程過程，對細胞的動態(tài)平衡和其在營養(yǎng)缺乏時的存活至關(guān)重要[11]。線粒體自噬可選擇性的清除受損的線粒體，完成對損傷線粒體的降解，維持適當(dāng)?shù)腞OS水平和細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。若線粒體自噬功能不足可導(dǎo)致能會導(dǎo)致產(chǎn)生過量的ROS，參與小膠質(zhì)細胞活化過程。Mizushima等[12]體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞活化模型中證實了自噬現(xiàn)象的存在，發(fā)現(xiàn)亞致死量的LPS可抑制細胞凋亡和自噬信號，延長活化的小膠質(zhì)細胞壽命。以往研究發(fā)現(xiàn)[13]，RAPA可抑制小膠質(zhì)細胞的活化及介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，LPS能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞中線粒體ROS的產(chǎn)生，RAPA聯(lián)合LPS處理線粒體ROS產(chǎn)生水平降低，提示了自噬誘導(dǎo)劑RAPA可能通過影響線粒體ROS水平抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化。

小膠質(zhì)細胞被LPS激活后，除增殖和形態(tài)學(xué)變化外，還表現(xiàn)為天然免疫細胞表面受體如CD14、MHC等的表達上調(diào)，遷移、吞噬及抗原提呈的功能增強；炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等及蛋白酶、活性氧等炎性介質(zhì)的分泌增多[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，RAPA可抑制LPS激活的小膠質(zhì)細胞內(nèi)NOS、NF-κB、COX等炎性因子的表達[15]。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等是小膠質(zhì)細胞活化中釋放的主要炎性因子，是介導(dǎo)神經(jīng)損傷的主要介質(zhì)。為證實自噬調(diào)控線粒體ROS進而影響小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)的作用機制，本研究應(yīng)用ELISA檢測了不同處理組小膠質(zhì)細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 以及 IL-12的水平。與上述報道相似，本研究結(jié)果證實，RAPA聯(lián)合處理組細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的水平顯著低于LPS單獨處理組，提示誘導(dǎo)細胞內(nèi)的自噬活動可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)[21,22]。

綜上所述，RAPA可降低LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞線粒體ROS表達及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎性細胞因子分泌水平。其具體作用機制尚有待于后續(xù)研究深入探討。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(31100824)。

姜忠信(E-mail：jzx99@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.010

R363

A

1002-266X(2016)27-0033-03

2016-01-05)