駱雨歡，李　樂△，楊　巍

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014;2.浙江大學(xué)藥學(xué)院，杭州310058)

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瞬時(shí)感受器電位M2通道抗原位點(diǎn)的兔單抗特異性檢測(cè)*

駱雨歡1，李樂1△，楊巍2

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014;2.浙江大學(xué)藥學(xué)院，杭州310058)

目的：篩選特異性較高的抗體以推動(dòng)對(duì)瞬時(shí)感受器電位M2(TRPM2)通道結(jié)構(gòu)和功能的研究。方法：以野生型昆明種小鼠大腦皮層、人胚腎293細(xì)胞、未誘導(dǎo)的TRPM2細(xì)胞及四環(huán)素誘導(dǎo)的TRPM2細(xì)胞為標(biāo)本，采用免疫印跡和免疫熒光方法，以被檢測(cè)抗體為一抗，熒光分子結(jié)合的抗體為二抗，根據(jù)170kD(TRPM2通道蛋白分子量)位置上是否有特異性條帶，檢測(cè)兔單抗的特異性。結(jié)果：抗體98927對(duì)鼠源TRPM2通道有特異性，抗體40622,抗體98721,抗體98921對(duì)人源TRPM2通道有特異性，另外抗體98721對(duì)鼠源TRPM2通道的突變型有特異性。結(jié)論：作為分子探針，抗體98927、40622、 98721、 98921可用于TRPM2通道結(jié)構(gòu)和功能研究。

TRPM2通道；兔單抗；特異性；免疫印跡

瞬時(shí)感受器電位M2型(transient receptor potential melastatin type2,TRPM2)通道是具有二磷酸腺苷核糖(adenosine diphosphoribose,ADPR)水解酶活性的非選擇性陽(yáng)離子通道。廣泛存在于腦組織、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中。此通道在氧化應(yīng)激反應(yīng)中被激活,常作為細(xì)胞氧化還原感受器[1]。它由四個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基有六次跨膜結(jié)構(gòu),在第五和第六次跨膜結(jié)構(gòu)間形成P-loop環(huán)，共同構(gòu)成離子通道。允許K+、Na+和Ca2+等陽(yáng)離子通過(guò)。當(dāng)胞內(nèi)ADPR與通道蛋白結(jié)合后,TRPM2通道開放[2]。Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞釋放胰島素,免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化和細(xì)胞死亡；繼而誘發(fā)糖尿病、心血管病、神經(jīng)退行性疾病和中風(fēng)等疾病。

大量研究表明，通道跨膜結(jié)構(gòu)上氨基酸殘基對(duì)通道功能起重要作用[3,4]。因此浙江希爾生物公司把通道六次跨膜結(jié)構(gòu)上(尤其是P-loop環(huán)部分)的氨基酸殘基作為抗原位點(diǎn)單抗對(duì)TRPM2通道上不同抗原位點(diǎn)的特異性，從中篩選出特異性高的抗體，作為研究研發(fā)出相應(yīng)的21個(gè)兔單克隆抗體。本課題通過(guò)免疫印跡和免疫熒光劑技術(shù)，檢測(cè)上述兔用探針，希望推動(dòng)TRPM2通道結(jié)構(gòu)和功能的研究。

1　材料與方法

1.1試劑

0.25%胰酶，瓊脂培養(yǎng)基(PS培養(yǎng)基)，TRPM2專用培養(yǎng)基(Z+B培養(yǎng)基)，加四環(huán)素培養(yǎng)基(Tet培養(yǎng)基)，0.06 μg/ml抑肽酶(Aprotinin),牛血清蛋白(BSA)，21只待篩選抗體(一抗，浙江希爾生物公司提供)，actin抗體(美國(guó)Santa Cruz.)，與熒光分子相連的二抗(武漢博士德生物公司)。

1.2細(xì)胞株及動(dòng)物

人胚腎293細(xì)胞，中科院上海生化所。清潔級(jí)昆明種小鼠四只，鼠齡8周，雌雄各半，體重18～21 g,單籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫20～25℃，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供。

1.3方法

本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠和人類的TRPM2通道蛋白作為檢測(cè)兔單抗特異性的樣本。取野生型昆明種小鼠(wide type，WT)大腦皮層組織直接作為樣本。采用四環(huán)素誘導(dǎo)人類TRPM2蛋白表達(dá)[5]，從細(xì)胞中提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.1組織樣本制備提取WT小鼠大腦皮層進(jìn)行勻漿,加入胰蛋白酶抑制劑和苯甲基磺酰氟(PMSF)。經(jīng)2 000 r/min離心10 min ，上清為組織內(nèi)蛋白，沉淀為細(xì)胞碎片。上清加入上樣緩沖液后經(jīng)高溫煮沸變性，經(jīng)電泳將不同分子量蛋白分離，從而與抗體接觸形成不同條帶。制備后-20℃保存。

1.3.2細(xì)胞樣本制備由于TRPM2通道蛋白在人類體內(nèi)的自然表達(dá)量不足以支持免疫印跡法來(lái)檢測(cè)抗體。故需要通過(guò)四環(huán)素誘導(dǎo)通道表達(dá)，選取人胚腎293細(xì)胞(HEK293)和未誘導(dǎo)的TRPM2細(xì)胞(uninduce TRPM2)作為陰性對(duì)照，當(dāng)uninduce TRPM2細(xì)胞密度長(zhǎng)到70%左右，加入四環(huán)素誘導(dǎo)TRPM2通道蛋白大量表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到90%左右即可開始傳代。首先棄去液體培養(yǎng)基，用Hank's液清洗細(xì)胞，再加入胰酶使細(xì)胞漂浮下來(lái)。短暫孵育后加正常培養(yǎng)基停止消化。離心獲得細(xì)胞沉淀，用PS培養(yǎng)基重懸后，將HEK293細(xì)胞加入PS培養(yǎng)基內(nèi)，uninduce TRPM2細(xì)胞加入Z+B培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻后放入CO2孵箱中培養(yǎng)。傳代三次后細(xì)胞狀態(tài)基本穩(wěn)定，可用來(lái)作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。三種細(xì)胞：HEK293，uninduce TRPM2,induce TRPM2,棄去培養(yǎng)基后用PBS沖洗2～3次。沿培養(yǎng)皿壁加入ripa裂解液用槍吹打數(shù)次，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，后移入37℃孵箱搖床裂解1 h，使細(xì)胞完全破裂。所得的液體按16 100×g，15 min，4℃離心，離心后取上清，加入上樣緩沖液后煮沸5 min，使蛋白部分變性，即得三者樣本。于-20℃保存。

取上述4種樣本，分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)不同分子量分開，然后將結(jié)合在凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，后用牛血清蛋白封閉，然后抗體用5%的牛血清蛋白稀釋(1∶500,100 μl)，4℃孵育過(guò)夜。一抗孵育完成后，用TBST(含吐溫的Tris-HCl緩沖鹽溶液)洗滌3次，每次15 min，再與熒光分子結(jié)合的二抗，按1∶5 000的效價(jià)孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。最后于掃瞄儀上顯色，最終結(jié)果以各抗體條帶和β-actin 的灰度比值表示抗體的特異性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

M:Marker;WT:Brain samples of wild type mice;HEK:HEK293;UN:Humanized cell samples without inducing the expression of the channel TRPM2;IN:Humanized cell samples of inducing the expression of the channel TRPM2

3　討論

本實(shí)驗(yàn)在15個(gè)蛋白泳道上檢測(cè)，TRPM2通道蛋白分子量為170 kD,所以從左向右第一個(gè)，第六個(gè)，第十一個(gè)泳道均加以量程為250的Marker，用于標(biāo)記條帶位置。每個(gè)抗體檢測(cè)需要文中提到的四個(gè)樣本，在結(jié)果圖片中分別以WT、HEK、UN、IN標(biāo)記。

本實(shí)驗(yàn)參照除Marker外，還設(shè)HEK293空白對(duì)照，針對(duì)induce TRPM2的uninduceTRPM2對(duì)照，actin作為內(nèi)參及陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)actin抗體是一種成熟的商業(yè)化抗體，其條帶可以作為篩選抗體的依據(jù)。

結(jié)果顯示，抗體98927對(duì)鼠源TRPM2通道有很好的特異性，抗體40622,98721,98921對(duì)人源的TRPM2通道蛋白有很好的特異性；同時(shí)，抗體98721對(duì)鼠源TRPM2通道突變型存在有很好的特異性；抗體98721同時(shí)對(duì)人源和鼠源的TRPM2通道蛋白存在特異性，可能與抗體雜質(zhì)或純度有關(guān)，抗體需要改造。本實(shí)驗(yàn)共篩選出98927，40622,98721,98921四種抗體，作為分子探針，可望用于TRPM2通道結(jié)構(gòu)和功能的研究。

[1]Jiang LH,Yang W,Zou J,et al.TRPM2 channel properties,functions and therapeutic potentials[J].Expert Opin Ther Targets，2010,14(9):973-988.

[2]Fliegert R,Gasser A,Guse AH.Regulation of calcium signalling by adenine-based second messengers[J].Biochem Soc Trans,2007,35(Pt 1):109-114.

[3]Xia R,Mei ZZ,Mao HJ,et al.Identification of pore residues engaged in determining divalent cationic permeation in transient receptor potential melastatin subtype channel 2[J].J Biol Chem,2008,283(41):27426-27432.

[4]Yang W,Zou J,Xia R,et al.State-dependent inhibition of TRPM2 channel by acidic pH[J].J Biol Chem,2010,285(40):30411-30418.

[5]錢鋒,潘衛(wèi)慶.在減毒傷寒桿菌 CVD908 疫苗株中四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)惡性瘧原蟲 MSP1—31 片段基因[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(1):51-53.

TRPM2 channel;rabbit monoclonal antibody;specificity;Western blot

2015-02-11

2015-12-14

△E-mail:lile1856@163.com;Tel:0571-88320320

R446

A

1000-6834(2016)02-168-03

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.019