韋舒靜　董利軍　魯曉嵐　曹　璋

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·論著·

艱難梭菌在腸易激綜合征和炎癥性腸病患者中的感染情況及與白細胞介素-8基因-251 A/T多態(tài)性的關系研究

韋舒靜董利軍魯曉嵐曹璋

目的探討艱難梭菌(C.difficile)在腸易激綜合征(IBS)和炎癥性腸病(IBD)患者中的感染情況及與白細胞介素8(IL-8)基因-251 A/T多態(tài)性的關系。方法研究選取經(jīng)澄城縣人民醫(yī)院消化內科及肛腸科診斷為IBS、潰瘍性結腸炎(UC)、克羅恩病(CD)的患者(分別為76 例、90 例、83 例)，同時選取90位健康志愿者作為對照組，比較C.difficile在各組中的感染情況，探討C.difficile感染與基因位點多態(tài)性的關系。結果UC 組、CD 組的感染率顯著高于IBS 組和對照組(P<0.05)，而IBS 組與對照組的C.difficile感染率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，UC 組與CD組的感染率差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。UC組血液中IL-8的濃度高于CD 組、IBS 組及對照組，而CD 組的濃度高于IBS 組和對照組，IBS 組及對照組血液中IL-8濃度的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論C.difficile感染可使患者血液中IL-8濃度升高，IL-8基因-251 A/T多態(tài)性AA基因型是C.difficile感染的危險因素。

艱難梭菌；腸易激綜合征；炎癥性腸病；感染率；白細胞介素8；多態(tài)性

近年來，由于抗生素在中國使用較頻繁且廣泛，艱難梭菌(C.difficile)相關性疾病的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢，并出現(xiàn)了新的毒力更強的菌株[1-3]。目前尚缺乏強有力的研究數(shù)據(jù)以準確、有效地評估在中國的不同人群中C.difficile的感染情況及危險因素，因此尚不能準確、全面地預防和治療C.difficile相關性疾病[4-6]。本研究探討了C.difficile在腸易激綜合征(IBS)患者、炎癥性腸病(IBD)患者及健康人群中的感染情況，并調查其感染的危險因素，為IBS、IBD的早期診斷及預防提供了科學依據(jù)，對于進一步控制C.difficile感染相關性疾病的發(fā)病率和病死率具有重要的理論和實踐指導意義。

1　材料及方法

1.1材料

收集2011年10月至2013年2月在澄城縣人民醫(yī)院消化內科及肛腸科被診斷為IBS 及潰瘍性結腸炎(UC)、克羅恩病(CD)患者的糞便及血液標本，其中最終納入研究的IBS 患者共有76 例，UC 患者共90 例，CD 患者共83例，同時收集90位健康志愿者的糞便及血液標本。C.difficile標準菌株購自中國微生物菌種保藏中心。

1.2方法

1.2.1標本的采集及儲存收集所有入選的人群未使用任何藥物前的第1次排便的糞便，用無菌便盒收集新鮮的糞便>500 mg(或水樣便>500 μL)，并于30 min內置于-80℃冰箱凍存，待測；收集入選人群血液2 mL，置-80℃冰箱凍存，待測。盡量避免反復凍融。

1.2.2糞便基因組DNA的提取步驟按照糞便基因組DNA 提取試劑盒說明書操作。

1.2.3C.difficile標準菌株的培養(yǎng)培養(yǎng)基配方：蛋白胨15 g、酵母粉5 g、大豆胨5 g、牛肉粉5 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、可溶性淀粉3 g、半胱氨酸0.5 g、磷酸二氫鉀2.5 g、氯化血紅素0.005 g、維生素K1 0.001 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。復蘇培養(yǎng)：用無菌吸管吸取約0.5 mL的液體培養(yǎng)基于安瓿管中使干燥菌種全部溶解，溶解后吸出并放入盛有4～5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，置于36℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.4聚合酶鏈法檢測C.difficile毒素設計針對C.difficile毒素B保守區(qū)的引物，以提取的糞便基因組DNA 為模板，其中陽性對照及陰性對照的模板分別以C.difficile標準菌株基因組DNA 及超純水代替，按照試劑盒要求進行操作。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附法檢測C.difficile毒素按照試劑盒要求進行操作，有效性判斷：陽性對照孔(B孔)平均值≥1.00，陰性對照孔(A孔)平均值≤0.10。臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。陰性判定：樣品光密度(OD)值<臨界值者為C.difficile毒素陰性；陽性判定：樣品OD值≥臨界值者為C.difficile毒素陽性。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附法檢測血液中白細胞介素-8的濃度按照試劑盒要求進行操作，以白細胞介素-8(IL-8)標準品的濃度及對應的OD 值，計算出標準曲線的直線回歸方程式，然后根據(jù)樣品的OD值，計算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1.2.7Sanger方法檢測IL-8基因-251 A/T 多態(tài)性以單條DNA 鏈為模板，合成其互補鏈，在合成原料(2′脫氧核苷酸)中摻入已用不同顏色熒光標記過的2′3′雙脫氧核苷酸，然后進行延伸反應，而合成互補鏈的反應會隨機終止，從而能夠在終止處得到大量的帶有標志物的DNA 片段，這些DNA片段長度不一，但僅相差1個bp，通過高分辨率的電泳分離，根據(jù)標志物的不同熒光顏色可測出堿基的序列，從而得到DNA 的序列。將擴增成功的樣品送測序公司測序。用DNAMAN軟件進行序列比對，同時打開峰圖查看待檢測位點的熒光信號。

1.3統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1基本資料

在所有的入選對象中，IBS 組共76例，其中男性37 例，女性39 例，平均年齡(32.72±4.06)歲；UC 組共90例，其中男性48例，女性42例，平均年齡(36.28±3.04)歲；CD組共83例，其中男性39例，女性44例，平均年齡(35.71±5.98)歲，正常對照組共90例，男、女各45例，平均年齡(34.56±4.37)歲。以疾病的嚴重程度區(qū)分，UC組病情為輕型的有17 例、中型41例、重型32例，而CD組輕、中、重型分別有43例、32例、8例，因此，UC 組的病情較CD 組更嚴重，可能會對本研究結果產(chǎn)生一定的影響。在UC患者和CD患者中，近期使用過質子泵抑制劑(PPI)的分別有39例、36 例，長期使用激素灌腸治療的分別有20 例、18 例，近期使用全身性糖皮質激素的分別有36 例、35 例，近期使用免疫抑制劑的分別有29 例、31 例，兩組中聯(lián)合使用激素及免疫抑制劑的均為8 例。UC 組中為初發(fā)患者的有18 例，CD 組有21 例；UC 組中疾病處于復發(fā)活動期的有51 例，CD 組有40 例。

2.2C.difficile的感染情況

各組患者的C.difficile感染率不同，由高到低依次為UC 組、CD 組、IBS 組、正常組。UC 組、CD 組的感染率顯著高于IBS 組和對照組(P<0.05)，而IBS 組與對照組的C.difficile感染率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，UC 組與CD組的感染率差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1　各組C.difficile感染情況比較

注：與正常組相比較，aP<0.05；與IBS組相比較，bP<0.05

注：圖1A、圖1B均左起依次編號，第1孔為MarkerⅠ，第2孔為陽性對照，第3孔為陰性對照，第4至第8孔為標本；MarkerⅠ最亮條帶處為400 bp。圖1A：陽性對照產(chǎn)物為173 bp，陰性對照無條帶出現(xiàn)，該組標本均無條帶出現(xiàn)，該組標本均未感染C.difficile；圖1B：陽性對照產(chǎn)物為173 bp，陰性對照無條帶出現(xiàn)，標本孔第4、5、6、7 孔均未出現(xiàn)條帶，為未感染C.difficile標本，第8 孔出現(xiàn)目的條帶，為C.difficile感染陽性。

圖1PCR 擴增檢測C.difficile毒素B 電泳圖

2.3血液中IL-8 濃度的比較

UC組血液中IL-8 濃度相較于CD 組、IBS 組和對照組高，且差異有統(tǒng)計學意義(F=24.944，P<0.01)，UC 組和CD 組濃度較IBS組和對照組高，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。這可能與不同疾病有關，若IBD患者的腸道黏膜炎性反應較嚴重，則受損更加嚴重，細胞連接被破壞，產(chǎn)生更多的IL-8。

表2　各組血液中IL-8濃度比較/ng·L-1

注：與正常組相比較，aP<0.01；與IBS組相比較，bP<0.01。Q1、Q3 分別是25%、75%百分位數(shù)。

UC 組患者中，C.difficile感染陽性患者血液中IL-8濃度高于未感染者，差異具有統(tǒng)計學意義(t=15.79，P<0.01)。CD 組患者中，C.difficile感染陽性患者血液中IL-8濃度高于未感染者，差異具有統(tǒng)計學意義(t=14.73，P<0.01)。見表3。

表3　UC 組、CD 組中陽性、陰性之間IL-8 濃度的比較

注：與陰性組相比較，aP<0.01

2.4C.difficile陽性、陰性者之間IL-8 基因-251 A/T 多態(tài)性研究

研究在所有C.difficile陽性者與陰性者之間進行比較，在31例陽性感染者中，AA、AT、TT 基因型所占比例依次為64.5%(20/31)、19.4%(6/31)、16.1%(5/31)；由此可知，C.difficile陽性感染者中血液IL-8基因-251位點多態(tài)性最多的基因為AA 型，其次為AT 型。研究結果提示，人血液中IL-8 基因-251 位點AA 基因型是C.difficile感染的一個危險因素。見表4。

表4　各組中C.difficile陽性、陰性者

注：與陰性組相比較，aP<0.05

3　討論

C.difficile感染的相對危險因素包括使用廣譜抗生素、伴有嚴重的基礎疾病、使用PPI、處于免疫抑制狀態(tài)、使用激素、老齡、近期有手術史以及出現(xiàn)毒力更強的新型產(chǎn)毒菌株等[1]。近年來的研究將一些暴露于腸道病原體和胃腸道感染后引起的IBS與“感染后IBS”的概念相結合。腸道微生物的改變和黏膜免疫反應已用于闡述IBS的發(fā)病機制，這種變化導致宿主和腸腔菌群之間關系紊亂，而這些可由腸胃炎進展而來，即一部分IBS可由腸胃炎治愈后進展而來[2-4]。C.difficile感染可導致腸道炎性反應，增加了腸道黏膜的通透性，使中性粒細胞聚集，破壞細胞之間的連接。而宿主體中缺少IgG抗體反應是初發(fā)和復發(fā)性C.difficile感染的一個重要的免疫學因素[5]。本文對C.difficile在IBS患者中的感染情況進行研究，旨在探討在IBS患者中是否會有更高的C.difficile感染率，以及IBS是否可作為C.difficile感染的一個危險因素。通過研究發(fā)現(xiàn)，雖然從研究結果可知IBS患者的感染率約是正常人群的兩倍，但兩者之間的差異卻無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這可能是由于本研究受到樣本量較小的限制。Clayton等[6]的研究納入了沒有相關危險因素的87例IBS患者，檢測出有5例感染C.difficile(5.7%)，其中有4例是產(chǎn)毒菌株(4.6%)，而在88例正常對照組中檢出1例C.difficile感染陽性(1.1%)。

IBD包括UC和CD，其發(fā)病機制尚不明確。IBD患者經(jīng)常因腹痛、腹瀉而住院，但其始發(fā)因素可能是基礎性疾病或者是感染了腸道的微生物或條件致病菌(如C.difficile)。在IBD患者中發(fā)現(xiàn)有越來越多的C.difficile感染者，C.difficile感染對于IBD患者的影響至今尚不清楚，但IBD患者具備很多C.difficile感染的危險因素，因此可以推測，IBD患者更容易感染C.difficile。因為大多數(shù)IBD患者的復發(fā)常常不能與C.difficile感染相區(qū)分，所以使部分研究較少意識到在IBD患者中C.difficile的感染情況。有研究報道在IBD的發(fā)病中，C.difficile感染占了5%～19%[7]。本研究中UC患者的C.difficile感染率并不高，這可能與樣本量較小、檢測方法不同以及納入的研究對象的病情輕重程度有關。

IL-8是一種炎性因子，在中性粒細胞趨化以及炎性反應過程中起著重要作用，但IL-8基因的多態(tài)性與C.difficile感染之間的關系尚不清楚。有研究表明，IL-8基因啟動區(qū)-251位點與人糞便中IL-8濃度增高有關[8]，而這可能與在入選研究對象時，UC組患者的病情程度較CD組嚴重有關。炎性反應嚴重時，必然會導致細胞連接破壞加重，將有更多的中性粒細胞聚集，IL-8濃度也將隨之增高。本研究納入的研究對象中UC組患者的病情較CD組嚴重，對血液中IL-8濃度也會產(chǎn)生一定的影響。

此外，本文對各組中C.difficile陽性和陰性者的血液IL-8基因-251位點多態(tài)性的差異進行了研究。結果指出，各組中除了對照組由于陽性例數(shù)過少，其他3組的陽性感染者中AA基因型所占比例較大，提示IL-8基因-251 A/T多態(tài)性AA基因型更容易發(fā)生C.difficile感染。

C.difficile感染相關性疾病的發(fā)病率越來越高，其危害性及所帶來的醫(yī)療負擔也越來越嚴重，及時、準確地了解C.difficile的感染情況及危險因素，能夠為C.difficile感染的預防、治療提供更好的幫助，對減少其發(fā)病率、提高治愈率有著重要意義。綜上所述，C.difficile在IBD患者中有較高的感染率；C.difficile感染所引發(fā)的炎性反應可增加各組陽性患者血液中IL-8的濃度；IL-8基因-251 A/T的多態(tài)性與C.difficile感染有關，該位點為AA基因型者更容易感染C.difficile，即IL-8基因-251 AA基因型是C.difficile感染的一個危險因素。

1 郭桂萍, 董創(chuàng)創(chuàng), 戴潔, 等. 艱難梭菌毒素A C端結構域在大腸桿菌中的可溶性表達與卵黃抗體的制備[J].軍事醫(yī)學, 2013, 37: 676-680.

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(本文編輯：周駿)

Clostridium difficile in patients with IBS, IBD infection situation and with IL-8 gene-251 A/T loci polymorphismWEIShujing.DepartmentofGastroenterology,People′sHospitalofChengchengCounty,Weinan(715200),China;DONGLijun.DepartmentofPharmacy,People′sHospitalofChengchengCounty,Weinan(715200),China;LUXiaolan.DepartmentofGastroenterology,TheSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an(710065),China;CAOZhang.DepartmentofPathologyTeachingandResearchSection,BinzhouMedicalCollege,Binzhou(256603),Shandong,China

ObjectiveAn attempt was made in this paper to investigate the clostridium difficile (C.difficile) bacteria in patients with irritable bowel syndrome (IBS), inflammatory bowel disease(IBD) infection situation and with IL-8 gene-251 A/T loci polymorphism. MethodsSeventy-six cases of IBS, ninety cases of ulcerative colitis(UC), eighty-three cases of Crohn′s disease(CD), and ninety cases of normal population were selected and the C. difficile infection in each group was compared to find out the relationship between C. difficile infection and polymorphic loci. ResultsThe infection rate of the UC group and CD group were higher than that of the IBS group and the normal group (P<0.05). There is no significant difference in C. difficile infection rate between the UC group and the CD group (P>0.05). The IL-8 in the UC group was higher than that in the CD group, the IBS group, and the normal group. There is no significant difference in IL-8 between the IBS group and the normal group (P>0.05). ConclusionC. difficile infection can increase the IL-8 and IL-8 gene -251 A/T is the risk factor for C. difficile infection.

Clostridium difficile; Irritable bowel syndrome; Inflammatory bowel disease; Infection rate; IL-8; Polymorphism

山東省自然科學基金青年基金項目(ZR2011HQ025)

715200陜西省渭南市澄城縣人民醫(yī)院消化內科(韋舒靜)；715200陜西省渭南市澄城縣人民醫(yī)院藥劑科(董利軍)；710065陜西省西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內科(魯曉嵐)；256603山東省濱州市濱州醫(yī)學院病理學教研室(曹璋)

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.02.013

2015-06-10)