王　寧，謝春玉，丁　靜，任　燕

(濱州醫(yī)學(xué)院，山東　煙臺(tái)　264003)

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HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷的含量*

王寧，謝春玉，丁靜，任燕

(濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái)264003)

采用高效液相色譜技術(shù)，測(cè)定不同產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷的含量。采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，乙腈(A)-水溶液(0.1%醋酸，B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～60 min，5%～30%A；60～70 min，30%～100%A)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果不同產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷的含量分別為江西1.08%、河南0.74%、湖南1.06%、四川0.61%、江蘇0.91%、山東1.66%、河北0.39%、安徽0.54%。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，能為評(píng)價(jià)半枝蓮的內(nèi)在質(zhì)量提供一定的依據(jù)。

半枝蓮；野黃芩苷；高效液相色譜

半枝蓮是唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbarta D. Don的干燥全草。別名通經(jīng)草、紫連草等[1]，性辛、寒，味苦，有清熱解毒、化瘀利尿的功效，半枝蓮常用于疔瘡腫毒，咽喉腫痛等的治療[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明半枝蓮藥理作用廣泛，具有抗腫瘤、抑菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等方面的作用[3]。《中華人民共和國(guó)藥典》2015版中，半枝蓮藥材的質(zhì)量主要通過(guò)總黃酮及野黃芩苷的含量來(lái)評(píng)價(jià)。黃酮類化合物是半枝蓮中主要的有效成分，含量最多的為野黃芩苷[4-7]。半枝蓮中野黃芩苷含量的高低與其療效有相關(guān)性。為評(píng)價(jià)半枝蓮的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)八個(gè)不同來(lái)源的半枝蓮藥材中的野黃芩苷進(jìn)行了含量測(cè)定，為充分利用半枝蓮藥材資源提供一定的參考。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1儀器與試藥

Waters 高效液相色譜儀；KQ5200B型超聲清洗器,昆山市超聲儀公司；TDL-4低速臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；TB-215D電子分析天平,丹佛儀器有限公司。

野黃芩苷(批號(hào)：S107670)購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，乙酸為分析純，水為超純水。藥材來(lái)自四川、山東、河南等8 個(gè)產(chǎn)區(qū)，由濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室陳彩云鑒定為唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbata D. Don的干燥全草。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水溶液(0.1%醋酸)，梯度洗脫(0 min，乙腈5%，水95%；60 min，乙腈30%，水70%；70 min，乙腈100%)；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm；進(jìn)樣量為20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　半枝蓮樣品(A)和野黃芩苷對(duì)照品(B)的HPLC圖Fig.1　The HPLC chromatogram of scutellaria barbata (A) and scutellarin (B)

1.2.2對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取野黃芩苷對(duì)照品2 mg，加甲醇定容至10 mL，配制成濃度為200 μg/mL的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。儲(chǔ)備溶液用甲醇按一定比例稀釋，最終配制成濃度為2、4、20、50、100、200 μg/mL的系列濃度對(duì)照品工作溶液。

1.2.3供試品溶液的制備

分別精密稱取不同產(chǎn)地半枝蓮粉末約0.05 g，置于10 mL離心管中，然后加入70%甲醇5 mL，搖均后超聲1.5 h，提取液4500 rpm離心10 min，取上清液即為供試品溶液。

1.2.4線性關(guān)系考察

精密吸取野黃芩苷系列濃度對(duì)照品工作溶液20 μL，注入高效液相色譜，根據(jù)上述的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以野黃芩苷的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=60647X+118064，R=0.9936。結(jié)果說(shuō)明野黃芩苷在2.04～204.5 μg/mL線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2　野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　The calibration curve of scutellarin

1.2.5精密度試驗(yàn)

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1　The results of precision (n=6)

取同一濃度的野黃芩苷對(duì)照品溶液(濃度：20 μg/mL)，連續(xù)進(jìn)樣6次，野黃芩苷峰面積的RSD為3.96%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

1.2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地的半枝蓮樣品(河南)，按“1.2.3供試品溶液的制備”方法處理，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，結(jié)果野黃芩苷峰面積的RSD為3.45%，表明重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2　The results of repeatability (n=6)

1.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取半枝蓮樣品(河南)一份，按“2.3供試品溶液的制備”方法處理，分別于0、4、8、12、16、20 h分別測(cè)定，結(jié)果野黃芩苷峰面積的RSD值為4.02%，表明樣品處理后20小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 3　The results of stability (n=6)

1.2.8加樣回收率測(cè)定

精密稱取已知含量的樣品(河南)6份，分別加入與供試品等量的對(duì)照品，平行制備6份供試品溶液，測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加樣收率，其回收率在100.0%～108.1%(RSD=3.14%)，表明測(cè)定方法穩(wěn)定可靠。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 4　The results of recovery (n=6)

1.2.9樣品的測(cè)定

精密稱取不同產(chǎn)地的半枝蓮樣品，照“1.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　不同產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果Table 5　The contents of scutellarin in herba scutellaria barbata from different places

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理方法的優(yōu)化和選擇

分別精密稱取等量的同一種半枝蓮粉末，置于10 mL離心管，然后分別加入70%甲醇和95%甲醇5 mL，超聲1.5 h，4500 rpm離心10 min，取上清液在相同的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果采用70%甲醇超聲提取峰面積相對(duì)較大。最終確定提取條件為70%甲醇超聲提取1.5 h。

2.2流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)直接采用乙腈(A)-水(0.1%醋酸，B)作為流動(dòng)相系統(tǒng)，通過(guò)更改洗脫梯度來(lái)進(jìn)行優(yōu)化和選擇。本實(shí)驗(yàn)分別采用條件1(0 min，5%A；60 min，30%A；70 min，100%A)和條件2(0 min，5%A；5 min，15%A；70 min，40%A；80 min，60%A)來(lái)分離半枝蓮中的野黃芩苷。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用條件1分離效果良好，半枝蓮與其他成分達(dá)到基線分離，且分析時(shí)間相對(duì)較短，所以最終選擇此條件作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相的洗脫條件。

2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)直接采用文獻(xiàn)報(bào)道的野黃芩苷[7]的檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4含量測(cè)定

根據(jù)測(cè)定結(jié)果可以看出，各產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷的含量均超過(guò)了0.30%，達(dá)到了《中華人民共和國(guó)藥典》2015版中規(guī)定的半枝蓮藥材中野黃芩苷含量的要求。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的8個(gè)產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷的含量分別為：江西1.08%、河南0.74%、湖南1.06%、四川0.61%、江蘇0.91%、山東1.66%、河北0.39%、安徽0.54%。由結(jié)果可以看出，不同地區(qū)半枝蓮中野黃芩苷的含量差別較大，山東產(chǎn)地的半枝蓮藥材中野黃芩苷的含量最高，這提示我們?cè)谥兴帍?fù)方及成方制劑中應(yīng)盡可能的選擇山東產(chǎn)半枝蓮，在所需的半枝蓮的量相同的情況下藥效能相應(yīng)得到提高，保證臨床用藥的安全性與有效性。

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷的含量測(cè)定方法。樣品前處理方法簡(jiǎn)單，分析時(shí)間適宜，所建立的方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適合對(duì)不同產(chǎn)地半枝蓮中的野黃芩苷進(jìn)行準(zhǔn)確的含量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為半枝蓮的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定的依據(jù)。

[1]黃泰康. 常用中藥成分與藥理手冊(cè)[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 1997:127.

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[3]楊連梅,劉量,胡榮,等. 半枝蓮化學(xué)成分的提取和含量測(cè)定方法研究[J]. 江蘇中醫(yī)藥, 2010, 42(2): 78-79.

[4]楊連梅, 劉量, 胡榮, 等. 半枝蓮化學(xué)成分的提取和含量測(cè)定方法研究[J]. 江蘇中醫(yī)藥, 2010, 42(2): 78-79.

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Determination of Contents of Scutellarin in Herba Scutellaria Barbata from Different Places by HPLC

WANGNing,XIEChun-yu,DINGJing,RENYan

(Binzhou Medical University, Shandong Yantai 264003, China)

The content of scutellarin of herba scutellaria barbata derived from different places was determined by HPLC. The analysis was carried out on an Agilent ZORBAX SB-C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) eluted with acetonitrile-water (0.1% acetic acid) in linear gradient condition (0～60 min, 5%～30%A, 60～70 min, 30%～100%A). The detection wavelength was 335 nm, the temperature of the column oven was 30 ℃, the flow rate was 1 mL·min-1, and the sample injection volume was 20 μL. As a result, the contents of scutellarin in herba scutellaria barbata from Jiangxi, Henan, Hunan, Sichuan, Jiangsu, Shandong, Heibei, Anhui were 1.08%, 0.74%, 1.06%, 0.61%, 0.91%, 1.66%, 0.39%, 0.54%, respectively. The established method was simple, accuracy, and the results can provide useful reference date for evaluate the intrinsic quality of herba scutellaria barbata.

scutellaria barbata; scutellarin; HPLC

山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃(J13LL80)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2013HL006)。

王寧(1992-)，女，濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)生，藥學(xué)專業(yè)。

任燕(1982-)，女，濱州醫(yī)學(xué)院講師，博士學(xué)位，主要從事藥物分析研究。

R917

A

1001-9677(2016)08-0117-03