韋樂華，孫婧媛，任慧文，劉健博，高與遠(yuǎn)，李黎明

(東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院生物技術(shù)研究所，遼寧　沈陽　110819)

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鎳離子對人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的研究*

韋樂華，孫婧媛，任慧文，劉健博，高與遠(yuǎn)，李黎明

(東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院生物技術(shù)研究所，遼寧沈陽110819)

探索了鎳離子對人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，從細(xì)胞生長活性、細(xì)胞形態(tài)等幾個(gè)方面入手，運(yùn)用MTT、姬姆薩染色等方法探索不同濃度的鎳離子對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。通過研究發(fā)現(xiàn)，氯化鎳對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的半數(shù)致死濃度為260 mg/L。在鎳離子作用下，HUVEC細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞形態(tài)有中毒樣改變，在觀察濃度及時(shí)間范圍內(nèi)，呈現(xiàn)濃度依賴和時(shí)間依賴趨勢。

鎳離子；血管內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞毒性

冠狀動(dòng)脈內(nèi)植入支架治療自20世紀(jì)80年代中期臨床應(yīng)用以來，得到了迅速的發(fā)展，已成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的主要方法之一。目前在臨床使用的金屬支架材料中，主要為316L不銹鋼、鈷鉻合金L605和NiTi合金等，其通常含有10%～14%的鎳元素[1]。

鎳是一種潛在的致敏因子，鎳及其化合物對人類最常見的損害是鎳接觸性皮炎。同時(shí)，早在20世紀(jì)30年代，就發(fā)現(xiàn)長期接觸鎳使癌癥發(fā)病率較高。同時(shí)鎳的毒性和致癌性還與其催化羧基、過氧化氫、氧氣等物質(zhì)產(chǎn)生自由基有關(guān)[2]。醫(yī)用金屬材料植入人體后，與血液發(fā)生直接接觸，所以支架的腐蝕會(huì)導(dǎo)致金屬離子釋放到臨近的組織中。

有研究表明，不銹鋼支架中鎳離子的釋放會(huì)導(dǎo)致過敏和再狹窄，而內(nèi)皮細(xì)胞可以在血管腔的表面形成一個(gè)抗凝血和抗血栓系統(tǒng)，維持血液在血管中的正常流動(dòng)的支架上的內(nèi)皮細(xì)胞有利于減輕和修復(fù)支架置入后損傷的血管內(nèi)皮，弱化誘發(fā)再狹窄的始動(dòng)因素，避免金屬支架與血流直接接觸，使血流平穩(wěn)，減少不良刺激，從而減輕細(xì)胞增殖引起的支架內(nèi)再狹窄和術(shù)后血栓的形成[3]。

本研究通過模擬體內(nèi)支架材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，即模擬鎳離子析出，觀察不同濃度的鎳離子對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。主要從細(xì)胞生長、形態(tài)、細(xì)胞毒性等幾個(gè)方面探索不同濃度的鎳離子對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。通過本研究，可以更深入地探討位于體內(nèi)的支架材料的鎳離子析出對于血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，從而為金屬支架的設(shè)計(jì)制造和優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料和試劑

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)，購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、姬姆薩染液以及MTT，均購于國內(nèi)生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

HUVEC用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(TBD)和1%的青鏈霉素，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞形態(tài)觀察

取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種至24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞數(shù)目為2×104。設(shè)對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組則加入不同濃度的氯化鎳培養(yǎng)液使得終濃度為7.813、15.625、31.25、62.5、125、200、250、400、500 mg/L。相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后分別取出棄去培養(yǎng)液，加入 PBS清洗2次。用4%的多聚甲醛固定，然后加入姬姆薩溶液染色15 min。在倒置顯微鏡下觀察不同藥物濃度下的細(xì)胞形態(tài)并拍照[8]。

1.4MTT測定細(xì)胞相對增值率

取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種至96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞數(shù)目為4×103個(gè)細(xì)胞，終體積為100 μL。設(shè)空白組和實(shí)驗(yàn)組，空白對照組加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的氯化鎳培養(yǎng)液，使得終濃度為7.813、15.625、31.25、62.5、125、200、250、400、500 mg/L[4-5]。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT溶液(5 mg/L) 20 μL再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μL。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在550 nm處檢測各孔的吸光值。致死率計(jì)算，致死率=(對照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對照孔吸光度值×100%。根據(jù)致死率和濃度關(guān)系做出致死曲線，通過線性關(guān)系得出半數(shù)致死濃度[6-7]。并計(jì)算細(xì)胞相對增值率(relative growth rate，RGR)，計(jì)算公式為：RGR=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？筛鶕?jù)RGR值，按照其與材料毒性級別的對應(yīng)關(guān)系對結(jié)果進(jìn)行分級。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)(x±s)標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與討論

2.1鎳離子對血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響

圖1　不同濃度的鎳離子在不同時(shí)間下對細(xì)胞形態(tài)的影響

經(jīng)不同濃度鎳離子分別處理24 h、48 h和72 h后，通過姬姆薩染色觀察HUVEC的細(xì)胞形態(tài)(圖1)。對照組細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)良好，細(xì)胞排列規(guī)則密集。從細(xì)胞數(shù)量上看，隨著鎳離子濃度的升高，細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少。細(xì)胞逐步呈現(xiàn)中毒狀態(tài)，活細(xì)胞比例降低，細(xì)胞胞體變小，成固縮狀態(tài)，貼壁能力下降。從作用時(shí)間上看，隨著鎳離子作用時(shí)間的延長，細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上逐漸呈現(xiàn)固縮的趨勢，細(xì)胞形態(tài)逐漸由細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則到細(xì)胞固縮，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)消失，直至僅剩下細(xì)胞核。

2.2鎳離子對血管內(nèi)皮細(xì)胞的半數(shù)致死濃度

圖2　血管內(nèi)皮細(xì)胞在不同鎳離子濃度下的抑制率

鎳離子對HUVEC的抑制率如圖2所示，可看出鎳離子與抑制率在一定范圍內(nèi)為線性關(guān)系，將該線性關(guān)系擬合后得出公式：y=0.0019x+0.0066，其中R2=0.9916，可見鎳離子濃度在62.5～400 mg/L之間與抑制率具有十分良好的線性關(guān)系，由此公式可計(jì)算出24 h時(shí)氯化鎳對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的半數(shù)致死濃度為260 mg/L。

2.3鎳離子對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

表1　血管內(nèi)皮細(xì)胞在不同時(shí)間和不同鎳離子濃度下的相對增殖率

圖3　血管內(nèi)皮細(xì)胞在不同時(shí)間不同鎳離子濃度下的相對增殖率

級別相對增殖率/%0≥100180～99250～79330～4940～29

表3　血管內(nèi)皮細(xì)胞在不同時(shí)間和不同鎳離子濃度下的細(xì)胞毒性級別

根據(jù)各不同鎳離子濃度組的細(xì)胞相對增殖率，依據(jù)細(xì)胞毒性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(表2)對各組結(jié)果進(jìn)行分級(表3)。根據(jù)結(jié)果可以看出，除對照組外，其余各濃度組均表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，且隨著濃度的增加及作用時(shí)間的延長，相應(yīng)的細(xì)胞毒性等級也出現(xiàn)增加的趨勢。當(dāng)鎳離子濃度較高時(shí)400 mg/L及500 mg/L，細(xì)胞的毒性等級集中于3～4級，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。當(dāng)鎳離子濃度不大于15.625 mg/L時(shí)，細(xì)胞毒性均不大于1級，當(dāng)鎳離子濃度為31.25 mg/L及以上時(shí)，所有細(xì)胞毒性級別均為2級以上。

3　結(jié)　論

本研究從細(xì)胞生長活性、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞毒性等幾個(gè)方面入手，運(yùn)用MTT、Giemsa染色等方法了觀察了不同濃度的鎳離子對HUVEC細(xì)胞增殖的影響。

目前許多研究表明，在介入治療過程中存在著內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。而且還有學(xué)者針對該損傷提出了“內(nèi)皮損傷—反應(yīng)”學(xué)說并得到廣泛的支持，該學(xué)說認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈壁對血管內(nèi)皮損傷所作出反應(yīng)的結(jié)果，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的各種危險(xiǎn)因素，最終都是通過不同途徑損傷動(dòng)脈內(nèi)膜。

通過對HUVEC細(xì)胞形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的刺激下，細(xì)胞形態(tài)和亞結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度的損害，如細(xì)胞回縮、胞漿空泡性改變、線粒體腫脹和細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則等改變，且隨著濃度的增大，破壞更加明顯[9]。

MTT法是日前常用的細(xì)胞毒性評價(jià)方法，其吸光度值大小可反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量的多少及細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。由結(jié)果分析可得，鎳離子對HUVEC細(xì)胞增殖活力具有明顯抑制作用，隨著濃度增加，時(shí)間延長，活細(xì)胞數(shù)量大幅減少。評價(jià)金屬離子的細(xì)胞毒性通常根據(jù)TC50，即可導(dǎo)致細(xì)胞半數(shù)死亡的離子濃度。對于HUVEC細(xì)胞，通過MTT實(shí)驗(yàn)，可以得出氯化鎳對HUVEC的TC50值大約為260 mg/L，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致[10]。而且隨著鎳離子濃度的增加，鎳離子對HUVEC的抑制率越高，并且在一定鎳離子濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出線性趨勢，同時(shí)隨著作用時(shí)間的延長，鎳離子對HUVEC的抑制率也逐漸上升。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著鎳離子濃度的增加，作用時(shí)間的延長，HUVEC細(xì)胞增殖受到明顯的抑制。提示時(shí)間和濃度是鎳離子細(xì)胞毒性效應(yīng)的兩個(gè)重要指標(biāo)。在對鎳離子的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià)時(shí)，需綜合考慮以上兩種因素的影響。

鎳離子溶出是使用含鎳支架的一個(gè)不可回避的問題，本研究觀察了鎳離子對HUVEC細(xì)胞增殖的影響。本研究僅從細(xì)胞增殖和細(xì)胞形態(tài)的改變對鎳離子的細(xì)胞毒性作一評價(jià)，全面認(rèn)識(shí)鎳離子的細(xì)胞毒性仍需從機(jī)制角度進(jìn)行進(jìn)一步探討。

[1]任尹賓, 楊柯, 梁勇. 醫(yī)用金屬材料中的鎳危害[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2005,22(5):1067-1069．

[2]劉靜, 程寧. 鎳化合物細(xì)胞毒理學(xué)研究的某些進(jìn)展[J]. 工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病, 2010,36(5):306-308．

[3]張海燕. 血管支架致血管再狹窄的體外實(shí)驗(yàn)研究[D]. 成都:西南交通大學(xué), 2006．

[4]Taira M, Toguchi M S, Hamada Y, et al. Studies on cytotoxic effect of nickel ions on three cultured fibroblasts[J]. Materials In Medicine, 2001, 12(5):373-376.

[5]Cortijo J, Milara J, Mata M, et al. Nickel induces intracellular calciummobilization and pathophysiological responses in human cultured airway epithelial cells[J]. Chemico-Biological Interactions, 2010, 183(1): 25-33.

[6]Ahamed M, Akhtar M J, Siddiqui M A. Oxidative stress mediated apoptosis induced by nickel ferrite nanoparticles in cultured A549 cells[J]. Toxicology, 2011, 283(2-3): 101-108.

[7]Ahamed M. Toxic response of nickel nanoparticles in human lung epithelial A549 cells[J]. Toxicology in Vitro, 2011, 25(4): 930-936.

[8]Laine L, Lewin D N, Naritoku W, et al. Prospectivecomparison of H&E Giemsa and Genta stains for the diagnosis of Helicobacterpylori[J]. Gastrointest Endosc, 1997, 45(6): 463-467.

[9]王琛, 夏露, 陳亞明. 鎳離子對小鼠成纖維細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 口腔醫(yī)學(xué), 2012,32(4):226-229．

[10]張貴, 程彩霞, 祁鳳君, 等. 鎳對體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的影響[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010,10(2):224-228．

Study on Influence of Nickel Ions on the Proliferation of Vascular Endothelial Cells*

WEILe-hua,SUNJing-yuan,RENHui-wen,LIUJian-bo,GAOYu-yuan,LILi-ming

(College of Life and Health Sciences, Northeastern University, Liaoning Shenyang 110819, China)

The influence of nickel ions on the proliferation of HUVEC cells (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) was evaluated. MTT and Giemsa stein were used to assess the cell viability and cell morphology under different concentrations of nickel ions. According to our research, the lethal dose 50 of Nickel Chloride was 260 mg/L. Inhibition rate increased with the increasing of concentrations of nickel ions and also increased with the time exposure to nickel ions. Ultrastructural alterations were observed including irregular shaped nuclei and the phenomena were dose dependent. Cellular proliferation of HUVEC was obviously inhibited by nickel ions. Cellular morphology of HUVEC became to be toxic state, and that was dose dependent and time dependent．

nickel ions; vascular endothelial cells; cell proliferation; cytotoxicity

遼寧省博士啟動(dòng)基金(No。20141010);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(N152004001)。

李黎明(1977-)，女，博士，主要從事生物材料方向的研究。

TH142.2

A

1001-9677(2016)010-0070-03

共同第一作者：韋樂華，孫婧媛。