李　冰，齊春麗

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林　132033；2.暨南大學(xué)實驗動物中心，廣東廣州　510632）

左乙拉西坦與苯妥英鈉協(xié)同抗小鼠最大電驚厥作用實驗研究

李冰1，齊春麗2

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林132033；2.暨南大學(xué)實驗動物中心，廣東廣州510632）

目的探討左乙拉西坦（Levetiracetam）與苯妥英鈉（Phenytoin Sodium）協(xié)同抗小鼠最大電驚厥的作用.方法昆明種小鼠200只，雌雄各半，隨機(jī)分為正常對照組、左乙拉西坦高中低劑量組、苯妥英鈉高中低劑量組，測定抗最大電驚厥作用的量效關(guān)系，并根據(jù)兩藥的量效關(guān)系確定左乙拉西坦與苯妥英鈉協(xié)同作用的高中低劑量組，每組20只小鼠，正常對照組給予等容積的生理鹽水，其余給予相應(yīng)的藥物，灌胃劑量10mL/kg.灌胃給藥后50min，給予小鼠電刺激，以小鼠下肢和全身出現(xiàn)強(qiáng)直性抽搐作為強(qiáng)直性驚厥指標(biāo)，記錄驚厥數(shù)，計算驚厥率.結(jié)果左乙拉西坦和苯妥英鈉兩藥均有良好的抗最大電驚厥作用的量效關(guān)系，選擇閾下劑量的左乙拉西坦和苯妥英鈉合用后，高劑量組的驚厥發(fā)生率為10%，中劑量組驚厥發(fā)生率為40%，能產(chǎn)生明顯的協(xié)同增效作用.結(jié)論閾下劑量的左乙拉西坦和苯妥英鈉合用具有明顯的協(xié)同抗小鼠最大電驚厥作用，并有良好的量效關(guān)系.

電驚厥；左乙拉西坦；苯妥英鈉；協(xié)同作用

【引用格式】李冰，齊春麗.左乙拉西坦與苯妥英鈉協(xié)同抗小鼠最大電驚厥作用實驗研究［J］.北華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，17（3）:352-354.

癲癇（Epilepsy，EP）是由多種原因引起的腦神經(jīng)細(xì)胞高度同步化異常放電，并以短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)為表現(xiàn)特征的臨床綜合征［1］，也是一種發(fā)病率較高、危害性較大的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾?。?］.癲癇分為原發(fā)性癲癇和繼發(fā)性癲癇，其突出的臨床特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作、每次發(fā)作的不可預(yù)知以及需要長期的藥物治療［3］.本實驗采用小鼠最大電刺激驚厥模型，探討左乙拉西坦與苯妥英鈉閾下劑量合用后是否可產(chǎn)生協(xié)同抗驚厥作用，為臨床合理安全、長期應(yīng)用抗癲癇藥提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1實驗動物

昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK（粵）2013-0002），實驗期間動物自由飲食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度（50±5）%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實驗.

1.2實驗藥品

左乙拉西坦（UCB Pharma SA，批號:330054）；苯妥英鈉（粉針劑，上海新亞藥業(yè)公司，批號: 9505101）.

1.3實驗儀器

YSD-4G型藥理生理實驗多用儀（北京卓川電子科技有限公司）.最大電驚厥通過預(yù)實驗確定誘致小鼠強(qiáng)直性驚厥的最大電刺激參數(shù)（刺激時間:0.25 s，波寬:2ms，頻率:4Hz，單次刺激，電壓:100V）.

1.4實驗分組

將200只小鼠分為對照組，左乙拉西坦高（74 mg/kg）、中（52mg/kg）、低（37.2mg/kg）劑量組，苯妥英鈉高（25mg/kg）、中（12.5mg/kg）、低（6.3mg/ kg）劑量組，進(jìn)行抗最大電驚厥作用的量效關(guān)系測定，并根據(jù)兩藥的量效關(guān)系確定左乙拉西坦與苯妥英鈉協(xié)同作用的高、中和低劑量組，每組20只小鼠，正常對照組給予等容積的生理鹽水，其余各組均給予相應(yīng)的藥物，灌胃劑量10mL/kg.灌胃給藥后50min按上述電刺激參數(shù)給予電刺激，以小鼠四肢強(qiáng)直性抽搐作為強(qiáng)直性驚厥指標(biāo).

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2　結(jié)　果

2.1左乙拉西坦抗小鼠最大電驚厥的量效關(guān)系

由圖1可見:左乙拉西坦對最大電刺激驚厥的拮抗作用與劑量有關(guān)，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，劑量達(dá)74mg/kg時，小鼠驚厥率為20%；而劑量為37.2 mg/kg時，驚厥率為85%.

2.2苯妥英鈉抗小鼠最大電驚厥的量效關(guān)系

由圖2可見:苯妥英鈉對最大電刺激驚厥的拮抗作用隨著劑量的增加，小鼠驚厥發(fā)生率明顯降低，并呈良好的量效關(guān)系，劑量達(dá)25mg/kg時，驚厥發(fā)生率為0，而劑量為6.3mg/kg時，驚厥發(fā)生率為85%.

2.3左乙拉西坦和苯妥英鈉協(xié)同抗最大電驚厥作用

根據(jù)左乙拉西坦和苯妥英鈉的抗最大電驚厥作用的量效關(guān)系，選擇閾下劑量左乙拉西坦37.2 mg/kg和苯妥英鈉6.3mg/kg作為合用的最高劑量組，依次稀釋為中劑量組（18.6mg/kg+3.2mg/kg）和低劑量組（9.3mg/kg+1.6mg/kg），并于給藥后50min開始行電刺激.結(jié)果見表1.合用高劑量組呈現(xiàn)明顯的抑制驚厥作用，驚厥發(fā)生率僅為10%，并呈良好的量效關(guān)系.

表1　閾下劑量的左乙拉西坦與苯妥英鈉協(xié)同抗小鼠最大電驚厥作用Tab.1　The anti-maximal electric seizure effect of subthreshold dose of levetiracetam and phenytoin sodium in m ice　（n=20，±s）

表1　閾下劑量的左乙拉西坦與苯妥英鈉協(xié)同抗小鼠最大電驚厥作用Tab.1　The anti-maximal electric seizure effect of subthreshold dose of levetiracetam and phenytoin sodium in m ice?。╪=20，±s）

注:與生理鹽水對照組比較，P＜0.01

組別　ω（劑量）/ （mg·kg-1）　驚厥　未驚厥　η（驚厥）/ % NS　—　18　2　90左乙拉西坦　9.3+1.6　17　3　85左乙拉西坦+苯妥英鈉　18.6+3.2　8　12　40苯妥英鈉　37.2+6.3　2　18　10

3　討　論

癲癇（EP）是神經(jīng)系統(tǒng)常見的慢性疾病，病程長且反復(fù)發(fā)作.抗癲癇藥物治療可以改善癲癇的發(fā)作情況，但長期用藥可使患者產(chǎn)生耐受性而降低藥效，或由于藥物的嚴(yán)重副作用而使患者治療的依從性降低，不能有效的控制癲癇發(fā)作［4］.因此，尋找高效低毒的治療癲癇的方法和有效藥物已經(jīng)成為研究熱點(diǎn).

左乙拉西坦屬吡咯烷衍生物，口服后吸收快且完全（＞95%），并快速達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，生物利用度高（近100%）［5-6］.動物實驗表明:左乙拉西坦對電刺激和PTZ點(diǎn)燃的小鼠癲癇大發(fā)作具有保護(hù)作用.臨床研究［3-7］表明:該藥安全范圍大，不良反應(yīng)少，耐受性好，用于治療難治性、部分性、發(fā)作性癲癇效果好.關(guān)于左乙拉西坦的抗癲癇機(jī)制尚未明確，認(rèn)為其抗癲癇作用與GABA能系統(tǒng)無關(guān)，因其并不影響腦組織中GABA轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫羧酶的活性［8］.左乙拉西坦抗癲癇作用具有立體結(jié)構(gòu)特異性.研究［9］表明:在中樞海馬等腦區(qū)的突觸膜上存在可以和3H-左乙拉西坦發(fā)生可逆性結(jié)合的特殊位點(diǎn)，并與其抗癲癇活性有關(guān).苯妥英鈉是經(jīng)典的抗癲癇藥物，其抗癲癇機(jī)制與其膜穩(wěn)定作用有關(guān).臨床上主要用于治療癲癇大發(fā)作，但不良反應(yīng)多，患者依從性較差.因此，本實驗研究將經(jīng)典的抗癲癇藥物苯妥英鈉與新近上市的左乙拉西坦聯(lián)合應(yīng)用，觀察閾下劑量的左乙拉西坦與苯妥英鈉聯(lián)合用藥后是否能夠產(chǎn)生協(xié)同的抗癲癇作用，為后續(xù)研究復(fù)方抗癲癇藥物提供實驗基礎(chǔ).

實驗采用對控制癲癇大發(fā)作有效的最大電驚厥法（maximal electric seizure，MES）［10］，測得苯妥英鈉和左乙拉西坦的量效關(guān)系，確定其閾下劑量分別是6.3mg/kg和37.2mg/kg.將兩藥的閾下劑量6.3mg/kg和37.2mg/kg作為高劑量組，并倍比稀釋為中劑量組（3.2 mg/kg+18.6mg/kg）和低劑量組（1.6mg/kg+9.3mg/kg）.聯(lián)合給藥后，測定動物發(fā)生驚厥情況，高劑量組驚厥發(fā)生率為10%，分別與苯妥英鈉12.5mg/kg和左乙拉西坦37.2mg/kg劑量相當(dāng)，而中劑量組驚厥發(fā)生率為40%，也呈現(xiàn)較好的抗癲癇作用.結(jié)果表明:閾下劑量的苯妥英鈉與左乙拉西坦聯(lián)合給藥具有明顯的協(xié)同抗小鼠最大電驚厥作用，其協(xié)同作用的產(chǎn)生可能與其不同的作用機(jī)制有關(guān).

由此可見，采用不同作用靶點(diǎn)的閾下劑量抗癲癇藥聯(lián)合應(yīng)用可以產(chǎn)生明顯的抗癲癇作用，為臨床合理、安全、長期應(yīng)用抗癲癇藥治療癲癇提供了實驗基礎(chǔ).

［1］Kannoth S，Unnikrishnan JP，Kumar T S，et al.Risk factors for epilepsy:A population-based case-control study in Kerala，southern India［J］.Epilepsy&Behavior，2009，16（1）:58-63.

［2］StrzelczykA.Cost of epilepsy:a systematic review［J］. Pharmacoeconomics，2008，26（6）:463-476.

［3］Klitgaard H，Matagne A，Gobert J，et al.Evidence for a unique profile of levetiracetam in rodentmodel of seizures and Epilepsy［J］.Eur J Pharmacol，1998，353（2-3）: 191-206.

［4］江澄川，俞麗云，洪震.顳葉癲癇［M］.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，2003:255-310.

［5］ Patsalos P N.Pharmacokinetic profile of levetiracetam: toward ideal characteristics［J］.Pharmacol Ther，2000，85 （2）:77-85.

［6］Bialer M Johannessen S I，Kupferberg H J，et al.Pro-gress report on new antiepileptic drugs:a summary of the fourth EILAT conference（EILAⅣ）［J］.Epilepsy Res-earch，1999，34（1）:1-41.

［7］Browne T R，Szabo G K，Leppik I E，et al.Absence of pharmacokinetic drug interaction of levetiracetam with phenytoin in patients with epilepsy determined by new technique［J］.JClin Pharmacol，2000，40（6）:590-595.

［8］Sills G J，Leach J P，F(xiàn)raser C M，et al.Neurochemical studies with the novel anticonvulsant levetiracetam in mouse brain［J］.Eur JPharmacol，1997，325（1）:35-40.

［9］Noyer M，Gillard M，Matagne A，et al.The novel antiepileptic drug levetiracetam（ucb L059）appears to act via a specific binding site in CNSmembranes［J］.Eur JPharmacol，1995，286（2）:137-146.

［10］Luszczki J J，Glowniak K，Czuczwar S J.Imperatorin enhances the protective activity of conventional antiepileptic drugs againstmaximal electroshock-induced seizures inmice［J］.Eur JPharmacol，2007，574:133-139.

【責(zé)任編輯：陳麗華】

Experimental Research on the Effects of Levetiracetam Combined with Phenytoin Sodium on Anti-maximal Electric Seizure in Mice

Li Bing1，Qi Chunli2
（1.Basic Medicine College of Beihua Uinversity，Jilin 132033，China；2.Experimental Animal Center of Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Objective To investigate the synergistic effect of levetiracetam combined with phenytoin sodium on anti-maximal electric seizure （ MES） in mice. Methods A total of 100 male and 100 female mouse were randomly divided into the normal control group，high dose levetiracetam group，middle dose levetiracetam group， low dose levetiracetam group，high dose phenytoin sodium group，middle dose phenytoin sodium group and low dose phenytoin sodium group.Dose-effect relationships of anti-MES were measured.According to the dose-effect relationships，the corresponding anti-MES’s effect drug doses were determined. They were high dose group， middle dose group and low dose group with 20 mouse in each group.The control group was given 10 mL /kg saline by gavage，and the other three groups were administrated the corresponding drugs.After 50 minutes，all the mice were treated with electricity.When the lower limbs and the whole body of the mice showed tonic convulsions，the convulsion frequencies were recorded and then the convulsion rates were calculated.Results Both levetiracetam and phenytoin sodium had good anti-electric convulsion effect and showed obvious dose-effect relationship.The combination use of subthreshold doses of levetiracetam and phenytoin sodium could produce synergistic antimaximal convusion effect，with convulsion rate of 10％ in high dose group and the rate of 40％ in middle dosegroup.Conclusion The subthreshold dose of levetiracetam and phenytoin has obvious synergistic anti-MES effect and shows a good dose-effect relationship.

MES；levetiracetam；phenytoin sodium；synergistic effect

R392.8

A

1009-4822（2016）03-0352-03

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.03.015

2015-12-01

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20130633）.

李冰（1964-），女，實驗師，主要從事機(jī)能實驗學(xué)研究，E-mail:bl5354@163.com；通信作者:齊春麗（1983-），女，博士，高級實驗師，主要從事抗癲癇藥物動物實驗學(xué)研究，E-mail:lovebaobei51@126.com.