崔超軍，李嘉敏，陳君宇，張潤釗，祝欽瀧

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煙草花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)基因NtAN9的分離與表達(dá)分析

崔超軍，李嘉敏，陳君宇，張潤釗，祝欽瀧*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，廣東省植物功能基因組與生物技術(shù)重點實驗室，廣州 510642)

為研究花青素苷的轉(zhuǎn)運，利用電子克隆和RT-PCR方法，從普通煙草(Nicotianatabacum)花中分離了1個編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因，命名為NtAN9(GenBank登錄號KX356542)。NtAN9包含一個690 bp的開放閱讀框，編碼229個氨基酸殘基，屬于phi型GST。NtAN9基因組結(jié)構(gòu)由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。多序列比對分析表明，NtAN9與矮牽牛(Petuniahybrida)花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST基因PhAN9具有88%的一致性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，NtAN9與花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST基因聚為一支，是PhAN9的直系同源基因。定量PCR分析表明，NtAN9基因在含有花青素苷的四個花發(fā)育時期中均有表達(dá)，其中在開花前的第Ⅲ期(2 cm <花芽<4 cm)表達(dá)豐度達(dá)到最高，而在不含花青素苷的根、莖和葉中不表達(dá)。由此推測，分離得到的NtAN9可能具有類似PhAN9的功能，與煙草花青素苷的轉(zhuǎn)運與積累相關(guān)。NtAN9基因的分離與表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究煙草花青素苷的轉(zhuǎn)運奠定了基礎(chǔ)。

煙草；花青素苷轉(zhuǎn)運；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶；基因克?。槐磉_(dá)分析

類黃酮和花青素苷生物合成是目前研究得較清楚的代謝途徑之一，但其后期階段從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到中央液泡的過程仍不是很清楚。目前研究表明，有4類蛋白，即谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)、多藥耐藥抗性相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)、多藥和有毒化合物排出家族(multidrug and toxic compound extrusion, MATE) 和同源于哺乳動物的膽紅素易位酶同族體(bilitranslocase-homologue, BTL-homologue)， 可能參與花青素苷向液泡的轉(zhuǎn)運，其中GST蛋白又是重要和基礎(chǔ)的一類[1]。

植物GST是一類含有多個成員的超基因家族，根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)和蛋白氨基酸同源性，分為可溶性的7類GST，即φ(phi，F(xiàn))、τ(tau，U)、θ(theta，T)、ζ(zeta，Z)、λ(lamda，L)、DHAR (dehydroascorbate reductase)和TCHQD(tetrachlorohydroquinone dehalogenase)，以及不溶性微粒GST，它們在植物的初生代謝和次生代謝中，通過底物特異性和轉(zhuǎn)運靶向 (液泡、胞外等)的不同，行使不同的功能[2]。φ和τ是植物特異的GST，種類也最多。首個克隆的花青素苷相關(guān)GST是玉米Bronze2基因，其編碼GSTⅢ蛋白，突變導(dǎo)致花青素苷不能在玉米籽粒中積累[3]。矮牽牛PhAN9基因編碼Bronze2的同源蛋白GSTI，突變導(dǎo)致花青素苷不能在矮牽?；ò曛蟹e累，其突變表型能夠被玉米Bronze2基因互補[4]。目前，通過GST基因突變體篩選和功能互補研究，已克隆了部分與花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST基因，如擬南芥AtTT19[5]、紫蘇(Perillafrutescens)PfGST1[6]、葡萄VvGST4[7]、仙客來CkmGST3[8]、香石竹DcGSTF2[9]和荔枝LcGST4[10]。盡管目前GenBank數(shù)據(jù)庫中已有多種植物GST基因，但與花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST報道依然不多[1]。

煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時也是一種用于花青素代謝調(diào)控研究的重要模式植物。目前煙草花青素苷合成途徑部分結(jié)構(gòu)基因和部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子已被克隆[11-12]，但至今未有花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST基因克隆的報道。本研究利用電子克隆的方法，以矮牽牛PhAN9核酸序列為探針，搜索煙草EST數(shù)據(jù)庫，拼接全長基因序列后，用RT-PCR方法快速分離獲得煙草花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST基因NtAN9，并對其在不同組織和不同花發(fā)育階段的表達(dá)特征進(jìn)行了研究，以期為驗證該基因功能進(jìn)而解析花青素苷轉(zhuǎn)運機制奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1植物材料

普通煙草(Nicotianatabacum)栽培品種K326，由實驗室保存，在正常的自然條件下生長。采集正常發(fā)育的煙草花芽和花朵，以及根、莖和葉保存于-80 ℃低溫冰箱，用于RNA提取。

1.2方法

1.2.1煙草基因組DNA提取、花RNA分離及cDNA第一鏈合成用SDS方法快速提取煙草嫩葉基因組DNA；用Invitrogen的Trizol試劑提取煙草根、莖、葉和花的4個時期的總RNA,各樣品用1 μg總RNA為模版，采用Promega的M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和OligodT Primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄條件為：42℃ 40 min，50 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

1.2.2煙草花青素苷的提取與測定煙草花發(fā)育的4個時期參考Pattanaik等的文獻(xiàn)報道[11]劃分：Ⅰ期(花芽<1 cm)、Ⅱ期(1 cm<花芽<2 cm)、Ⅲ期(2 cm <花芽<4 cm)和Ⅳ期(盛花期)。煙草花青素苷的提取采用Zhu等報道的方法[13]，用1% 鹽酸甲醇4 ℃避光抽提過夜，然后用分光光度儀分別測量樣品在530 nm和650 nm的光吸收值A(chǔ)，按公式[(A530-0.25×A650)/每克鮮重]計算花青素苷的相對含量。

1.2.3煙草NtAN9基因全長序列的克隆采用電子克隆的方法，用矮牽牛PhAN9基因(Y07721)cDNA 序列作為探針，在NCBI網(wǎng)站的expressed sequence tags (EST)數(shù)據(jù)庫和genomic survey sequence(GSS)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸序列搜索與比對，得到與PhAN9高度相似的煙草EST和GSS序列，再用這些序列在上述數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步進(jìn)行搜索，最終獲得的所有序列用DNAman軟件對所獲得的EST和GSS序列進(jìn)行多重比對和Contig拼接。根據(jù)多重比對和拼接的結(jié)果，設(shè)計5′和3′-末端特異引物F-NtAN9 (5′-ATGGTAGTGAAGGTGTATGGTTCAG-3′)和R-NtAN9 (5′-TTAAAGTTTTACTTCTTTAAATAGGGGTGCAG-3′)用于擴增NtAN9全長cDNA編碼區(qū)序列和對應(yīng)的基因組序列。

RT-PCR以煙草花cDNA第一鏈1 μL為模版，采用TOYOBO高保真的KOD FX酶進(jìn)行50 μL標(biāo)準(zhǔn)PCR體系擴增，參數(shù)如下：95 ℃ 預(yù)變性2 min，35個擴增循環(huán)(95 ℃ 變性1 min，58 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸2 min)，72 ℃ 再延伸5 min。NtAN9基因組DNA擴增，除用煙草嫩葉DNA為模板外，其它擴增條件同RT-PCR條件。將上述獲得的PCR產(chǎn)物膠回收后，經(jīng)過T-A克隆，單克隆子PCR檢測后，選陽性克隆子測序。

1.2.4煙草NtAN9基因的生物信息學(xué)分析NtAN9基因的分子特征分析主要采用Vector NTI Suite 10.0軟件包進(jìn)行Open Reading Frame(ORF)查找和翻譯、蛋白質(zhì)基本性質(zhì)。NCBI網(wǎng)站在線工具BLAST分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域搜索。應(yīng)用ExPASy、Softberry、CBS和Psort等網(wǎng)上綜合軟件包，進(jìn)行編碼蛋白的基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點等的預(yù)測分析。使用CLUSTAL X(1.83)軟件對不同GST蛋白序列進(jìn)行多重比對以后，再使用Mega6.0軟件中的鄰位相連法(NJ法)，采用Bootstrap 1000次，完成系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.5煙草NtAN9基因的表達(dá)模式分析利用Primer 5.0軟件，設(shè)計NtAN9基因的實時熒光定量PCR引物FqRT-NtAN9(5′-CATCTATGAACAAAGGTTGTCC-3′)和RqRT-NtAN9(5′-CAAACACTTTCTCTCCGTTACC-3′),以NtGAPDH基因作為內(nèi)參，引物為F- GAPDH(5′-CTGCTCACTTGAAGGGTGGT-3′)和R- GAPDH (5′- GGGAGCAAGGCAATTTGTGG-3′)。以煙草根、莖、葉和花的4個發(fā)育時期cDNA為模板，采用寶生SYBR Green Master Mix 試劑盒的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，在BioRad IQ5 real-time PCR儀上完成熒光定量PCR。反應(yīng)程序為：95 ℃ 預(yù)變性15 s， 58 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸15 s，40個循環(huán)。每樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)。

2　結(jié)果和分析

2.1NtAN9基因的克隆與核酸序列特征

通過PhAN9基因序列BLASTn分析煙草EST數(shù)據(jù)庫和GGS數(shù)據(jù)庫后，共獲得煙草AN9基因的2條EST序列和6條GSS序列。采用DANman軟件進(jìn)行EST和GSS序列多重比對和拼接后，獲得一條長2 317 bp的Contig序列。通過進(jìn)一步搜索Contig序列編碼區(qū)ORF，發(fā)現(xiàn)一個有3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成的ORF。BLASTn分析表明該序列編碼區(qū)與矮牽牛PhAN9基因核酸具有89%的一致性，可以初步認(rèn)定其為煙草AN9基因(圖1)。

以F-NtAN9和R-NtAN9擴增引物，RT-PCR擴增煙草花cDNA后，獲得1條約600 bp 的特異條帶，膠回收、T-A克隆和測序。測序結(jié)果表明，煙草AN9基因cDNA ORF全長為690 bp，編碼229個氨基酸(圖1)，命名為NtAN9，GenBank 登錄號為KX356542。以煙草嫩葉gDNA為模板，擴增NtAN9基因組DNA。其gDNA從起始密碼子到終止密碼子長為1 538 bp，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。內(nèi)含子總長為848 bp，其中內(nèi)含子Ⅰ為225 bp，內(nèi)含子Ⅱ為623 bp(圖2)，序列符合標(biāo)準(zhǔn)的GT-AG內(nèi)含子剪接法則。其基因組結(jié)構(gòu)與大多數(shù)花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST基因的結(jié)構(gòu)一致。

起始密碼子ATG用粗體表示，終止子TAA用粗體和星號表示；N端保守結(jié)構(gòu)域GST_N_Phi(M10～K77)用單下劃線表示；C端保守結(jié)構(gòu)域GST_C_Phi(E91～L209)用雙下劃線表示；陰影為保守的GSH活性位點，方框為保守的底物結(jié)合位點。圖中左邊數(shù)字代表核酸數(shù)字。箭頭位置表示外顯子間的交界處圖1　NtAN9基因的核酸序列及推定氨基酸序列The ATG initiation codon is bold, and the TAA termination codon is in bold and indicated by five-pointed star. The N-terminal conserved domain GST_N_Phi(M10～K77) and the C-terminal conserved domain GST_C_Phi(E91～L209) are single and double underlines, respectively. The GSH sites are marked with gray background, and the substrate binding sites are marked in box. The two vertical arrows indicate the splice sites between exonsFig. 1　cDNA sequence and the deduced amino acid sequence of NtAN9

2.2NtAN9基因編碼蛋白的特征和同源性分析

NtAN9蛋白長度為229 個氨基酸(aa)，分子量(Mw)為26.34 kDa，等電點(pI)為5.76，其中極性氨基酸比例20.96%，堿性氨基酸比例為13.97%，酸性氨基酸比例為12.22%。含量最豐富的為亮氨酸Leu，占總氨基酸的13.57%，其次是Val和Lys，分別占9.17%和8.73%。 NtAN9蛋白特征與PhAN9蛋白高度相似。Blastp的保守域搜索表明，NtAN9具有GST_N_Phi(M10～K77)和GST_C_Phi(E91～L209)兩個保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，說明NtAN9基因?qū)儆趐hi類型GST超基因家族蛋白成員。一般可溶性GST是以蛋白二聚體的形式行使功能，每個約26 kD亞基都包含獨立的GSH 特異結(jié)合位點(G 位點)和結(jié)合疏水底物的位點(H位點)，通常G 位點保守，H 位點結(jié)構(gòu)可變性較大。NtAN9中的G位點在同類型GST蛋白中是高度保守和一致的，而H位點保守性相對較低(圖1，圖3)。

多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，NtAN9與花青素苷相關(guān)的GST蛋白序列具有較高的一致性，其中與矮牽牛的PhAN9具有最高的一致性，達(dá)88%；與擬南芥AtTT19、紫蘇PfGST1、葡萄VvGST4和荔枝LcGST4等也具有較高的序列一致性, 其范圍在53%～70% 之間。NtAN9與這些GST蛋白在酶活功能相關(guān)的保守氨基酸和功能結(jié)構(gòu)域上表現(xiàn)出高度一致性(圖3), 說明它們可能具有相似的功能。

2.3NtAN9基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

在多序列比對的基礎(chǔ)上，用MEGA6.0軟件，選用NJ法，bootstrap 1 000次，構(gòu)建了NtAN9基因與已知花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)GST基因及其它類型的GST基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。對構(gòu)建的NJ樹分析發(fā)現(xiàn)，整個系統(tǒng)樹分為3個大支，其中NtAN9首先與同為茄科的矮牽牛PhAN9聚在一起，再與紫蘇PfGST1、葡萄的VvGST4、荔枝LcGST4和擬南芥AtTT19聚類在一起形成獨立的一個大支，而其它類型的GST分別形成不同的支。這意味著NtAN9屬于花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST基因家族，具有相似的花青素苷轉(zhuǎn)運功能。綜合Blasts、蛋白序列多序列比對分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果，說明NtAN9基因就是矮牽牛PhAN9 基因的直系同源基因，暗示著其具有與之相同的轉(zhuǎn)運功能。

圖2　煙草NtAN9基因組結(jié)構(gòu)Fig. 2　The genomic structure of common tobacco NtAN9 gene

黑色背景表示完全一致的氨基酸序列。五角星表示保守的GSH活性位點，三角形表示底物結(jié)合位點圖3　煙草NtAN9與其它植物已知花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST蛋白的多序列比對Shades in black represent identical amino acids among the homologous proteins. Highly conserved GSH active sites are marked with five-pointed star. Triangle indicates substrate binding sitesFig. 3　The multiple sequence alignment of NtAN9 with known-function anthocyanin transport-related GST proteins

圓點代表本研究的NtAN9在系統(tǒng)發(fā)生樹中的位置圖4　煙草NtAN9蛋白與其它植物不同類型GST蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹The dot indicates NtAN9 position in the phylogenetic treeFig. 4　Neighbor joining phylogenetic tree of the complete sequences of NtAN9 and other plant GST

Ⅰ.花芽<1 cm；Ⅱ. 1 cm<花芽<2 cm；Ⅲ. 2 cm<花芽<4 cm； Ⅳ. 盛花期。下同圖5　煙草不同組織花青素苷含量分析Ⅰ. flower bud<1 cm；Ⅱ. 1 cm

圖6　NtAN9基因在煙草不同組織和花不同發(fā)育時期的表達(dá)分析Fig. 6　NtAN9 expression pattern analysis in different tobacco tissues and different flower developmental stages

2.4NtAN9基因表達(dá)模式分析

對煙草根、莖、葉和4個發(fā)育時期的花(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)的花青素苷含量分析表明(圖5)，煙草花青素苷主要存在于花中，在Ⅰ期(花芽<1 cm)和Ⅱ期(1 cm <花芽<2 cm)花中含量較低，當(dāng)Ⅲ期(2 cm <花芽<4 cm)時含量顯著增加，到Ⅳ期(盛花期)時達(dá)到最高含量。而在根和其它綠色組織中含量很低。

qRT-PCR分析NtAN9基因在煙草各組織的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，在含有花青素苷的4個發(fā)育時期的花中具有較高豐度表達(dá)，而在不含花青素苷或含量極少的根、莖和葉中表達(dá)量很低(圖6)。而在花發(fā)育的Ⅰ期和Ⅱ期中盡管花青素苷含量較低，但NtAN9基因的表達(dá)豐度快速增加，到第Ⅲ期時達(dá)到最大表達(dá)值，而在花青素苷含量最高的Ⅳ盛花期，表達(dá)下降。這一結(jié)果說明，NtAN9基因的表達(dá)模式與花青素苷積累模式密切相關(guān)，也與積累花青素苷的組織的發(fā)育相關(guān)。

3　討　論

花青素苷的生物合成主要是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成，包括花青素的合成、修飾、轉(zhuǎn)運三個過程，只有當(dāng)穩(wěn)定的花青素苷轉(zhuǎn)運并積累至液泡中時才有可能呈色。目前研究表明，植物GST超家族的某些成員直接參與了花青素苷的轉(zhuǎn)運。本研究利用電子克隆策略和RT-PCR方法，從煙草花中分離了與花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST蛋白基因NtAN9。

多序列比對分析表明，NtAN9與已報道的花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST 具有很高的一致性，以及相同的保守結(jié)構(gòu)域與催化位點，其中與同為茄科的矮牽牛PhAN9[4]序列一致性最高達(dá)88%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)GST 在物種之間具有高度保守性，NtAN9屬于花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的Phi類型GST，是PhAN9的直系同源基因，提示它們具有相似的功能。

表達(dá)模式分析表明，NtAN9的表達(dá)主要在積累花青素苷花發(fā)育的4個時期中，而在不含花青素苷的其他部位幾乎無表達(dá)，其表達(dá)模式與花青素苷積累模式密切相關(guān)。這與已報道的花青素苷轉(zhuǎn)運相關(guān)的GST基因的表達(dá)模式相符合[1]。如參與花青素苷轉(zhuǎn)運的紫蘇PfGST1表達(dá)與紫蘇不同組織花青素苷積累模式相吻合[6，14]，瓜葉菊ScGST3在含花青素苷的品系和組織中高表達(dá)，而在不含或含少量花青素苷的品系和組織中幾乎不表達(dá)[15]。此外，NtAN9的表達(dá)與積累花青素苷的組織發(fā)育相關(guān)，即在花發(fā)育早期(Ⅰ至Ⅲ期)表達(dá)上升，而在發(fā)育后期(Ⅳ盛花期)、完全著色后表達(dá)下降，這與矮牽牛PhAN9[4]、仙客來CkmGST3[8]，以及ScGST3 在舌狀花中的表達(dá)結(jié)果類似[15]。

上述結(jié)果表明，NtAN9編碼的GST蛋白可能參與了煙草花青素苷的轉(zhuǎn)運和積累。NtAN9基因的克隆以及表達(dá)模式的分析，將為進(jìn)一步研究其在煙草花呈色中的功能和花青素苷轉(zhuǎn)運奠定基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Isolation and Expression Analysis of an Anthocyanin Transport-relatedNtAN9 Gene fromNicotianatabacum

CUI Chaojun, LI Jiamin, CHEN Junyu, ZHANG Runzhao, ZHU Qinlong*

(College of Life Sciences, South China Agricultural University, State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Biotechnology，Education Department of Guangdong Province, Guangzhou 510642 China)

To study anthocyanin transport, we isolated a full-length geneNtAN9 (GenBank Accession No. KX356542) byinsiliconcloning and RT-PCR method fromNicotianatabacum. TheNtAN9 contains a 690 bp open reading frame (ORF) encoding 229 amino acid residues, which belongs to a putative phi class glutathione s-transferase (GST) family. Its genomic structure contains 3 exons and 2 introns. Multiple sequence alignment showed that NtAN9 has highest identities (88%) with petunia PhAN9 that is an anthocyanin transport-related GST. Phylogenetic analysis showed thatNtAN9 was clustered into an anthocyanin transport-related GST group, and was an ortholog ofPhAN11. The anthocyanin content analysis and real-time quantitation PCR (qRT-PCR) showed thatNtAN9 was expressed in different flower developmental stages, with highest level in stage Ⅲ, but almost no expression in root, stem and leaf which are almost no anthocyanin. These results suggest that theNtAN9 function is similar withPhAN9 and might be related to the transfer and accumulation of anthocyanin in tobacco plants.

Nicotianatabacum; anthocyanin transport; glutathione s-transferase; gene clone; expression analysis

1000-4025(2016)07-1337-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1337

2016-06-06;修改稿收到日期:2016-06-18

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610564006)；廣東省公益研究與能力建設(shè)項目(2016A020210084)

崔超軍(1992-)，男，在讀本科生，主要從事植物基因工程研究。E-mail: chaojun_cui@163.com

祝欽瀧，博士，助理研究員，主要從事植物基因工程研究。E-mail: zhuql@scau.edu.cn

Q785; Q786

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