張　朋，賈　笑，鄧　帥，單麗偉，范三紅*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西楊陵 712100)

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小麥β-胡蘿卜素異構(gòu)酶基因定位克隆及表達(dá)分析

張朋1，賈笑1，鄧帥1，單麗偉2，范三紅1*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西楊陵 712100)

β-胡蘿卜素異構(gòu)酶(D27)是獨腳金內(nèi)酯(SLs)合成通路的第一個酶。該研究以普通小麥‘中國春’為材料，通過RT-PCR克隆了小麥β-胡蘿卜素異構(gòu)酶對應(yīng)cDNA(TaD27)，并對其在不同組織和低磷脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：(1)克隆獲得2個高度同源cDNA片段，分別定位于7A、7D 染色體的長臂，命名為TaD27-7AL和TaD27-7DL；序列分析發(fā)現(xiàn)，7B染色體長臂上還存在另一個同源基因TaD27-7BL。(2)3個TaD27基因均包含7個外顯子，編碼區(qū)長度分別為828 bp(7AL)、840 bp(7BL) 和843 bp(7DL) ，編碼蛋白的N-端均含有葉綠體轉(zhuǎn)運肽；進(jìn)化分析表明，植物D27蛋白主要聚集在3個進(jìn)化枝中，小麥、水稻和玉米等單子葉植物的D27高度同源，聚集在同一進(jìn)化分枝。(3)組織表達(dá)分析表明，TaD27基因在葉、葉鞘和莖中的表達(dá)量較高，在幼穗中的表達(dá)量相對較低，在根中的表達(dá)量最低；低磷脅迫下，TaD27在根中的表達(dá)量先下降后升高，脅迫至6～12 h時，表達(dá)量達(dá)到最低，96 h時基本恢復(fù)至初始狀態(tài)，而在葉中表達(dá)量則是先升高后下降，6 h達(dá)到峰值，12 h基本恢復(fù)到初始水平，隨后表達(dá)量繼續(xù)下降。

小麥；D27；染色體定位；基因結(jié)構(gòu)；表達(dá)模式

獨腳金內(nèi)酯(SLs)最初在棉花中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是一種促進(jìn)根寄生雜草種子萌發(fā)的誘導(dǎo)物[1]。此后的研究發(fā)現(xiàn)，SLs還可以促進(jìn)植物與叢枝菌根真菌形成共生關(guān)系[2-3]。2008年，Gomez-Roldan等發(fā)現(xiàn)，豌豆多分枝突變體rms1表現(xiàn)出SLs合成缺陷的性狀，而外部施加獨腳金內(nèi)酯類似物GR24后，其可恢復(fù)至野生型狀態(tài)，證明了獨腳金內(nèi)酯可以調(diào)控植物分枝[4]。植物的分枝是一種重要的形態(tài)學(xué)性狀，因此SLs調(diào)控植物分枝的功能受到廣泛關(guān)注。

SLs是一些萜類內(nèi)酯的總稱，它們源于類胡蘿卜素。近年來有關(guān)SLs生物合成通路的研究取得了重要進(jìn)展，目前為止已有4種參與該通路的酶被確認(rèn)，分別是β-胡蘿卜素異構(gòu)酶(D27)、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7(CCD7)、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶8(CCD8)和細(xì)胞色素P450家族成員MAX1。2012年，Alder等[5]確定了該通路的前三步反應(yīng)，即D27可催化全反式β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為9-順-β-胡蘿卜素，再由CCD7和CCD8分別進(jìn)行裂解和分子重排，生成類胡蘿卜素內(nèi)酯(carlactone，CL)。2014年Satoko Abe等[6]利用酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得重組擬南芥AtMAX1，該酶可將 CL轉(zhuǎn)化為類胡蘿卜素內(nèi)酯酸(carlactonoic acid，CLA)，其甲酯后的化合物(MeCLA)在體外可與SLs受體蛋白AtD14互作。

D27是SLs合成通路的第一個關(guān)鍵酶，其編碼基因(OsD27)最初在水稻矮化突變體dwarf27中發(fā)現(xiàn)，這種突變體植株表現(xiàn)出多分枝、株型矮小和SLs合成缺陷的特征，并且在施加外源SLs類似物后，其表型可以恢復(fù)至野生型，這表明其與SLs的合成相關(guān)。OsD27位于11號染色體上，包含7個外顯子，編碼一個含有非血紅素鐵離子的蛋白，定位于葉綠體[7]。Waters等[8]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥D27基因(AtD27)在不同組織中的表達(dá)模式與MAX3(CCD7)和MAX4(CCD8)不同，其在地上部分的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根中的表達(dá)量，并且AtD27表達(dá)量會受到SLs合成匱乏、生長素處理、去除植株頂芽等信號的刺激而上調(diào)，但是變化量并不大。低磷脅迫條件下，通常SLs合成量會增加，植株表現(xiàn)出分枝減少、株型矮小、側(cè)根增多等表型[9-11]，但是目前關(guān)于低磷脅迫下SLs合成相關(guān)基因表達(dá)量的動態(tài)變化研究尚未見報道。Umehara等[9]對水稻SLs合成相關(guān)基因OsD10(CCD8)、OsD17(CCD7)和OsD27等在低磷脅迫2周后恢復(fù)正常磷營養(yǎng)后的表達(dá)量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其均呈現(xiàn)下降的趨勢，并且根部SLs的合成量也會下降，側(cè)芽的生長得到恢復(fù)。

目前，關(guān)于小麥SLs合成和調(diào)控信號通路的研究尚未見報道。本研究以O(shè)sD27基因為參考，以EST拼接結(jié)果為依據(jù)，通過反轉(zhuǎn)錄PCR同源克隆到小麥D27(TaD27)基因cDNA，分析了其基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和進(jìn)化關(guān)系，并且通過熒光定量PCR的方法分析了其在不同組織和低磷脅迫條件下的表達(dá)模式。

1　材料與方法

1.1植物材料

用于組織表達(dá)模式研究的部分小麥組織材料來自西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗田拔節(jié)期的‘中國春’(TriticumaestivumL.)。在植株拔節(jié)期，分別剝?nèi)∑淙~鞘、幼穗以及緊鄰幼穗的莖，用液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用于低磷脅迫下表達(dá)模式研究的小麥材料為本實驗室保存的‘中國春’種子。小麥幼苗的培養(yǎng)和低磷脅迫方法參考Kaori Yoneyama的方法[12]， 將挑選的籽粒飽滿的小麥‘中國春’種子用70%酒精消毒2 min，1% NaClO溶液滅菌5 min，腹線朝下置于1個鋪有滅菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌水潤濕后于4 ℃黑暗條件下放置2 d，然后置于25 ℃黑暗條件下萌發(fā)2 d。萌發(fā)后的幼苗先用自來水培養(yǎng)5 d，然后用1/2 TT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)5 d，之后用去掉磷酸鹽的1/2 TT培養(yǎng)基進(jìn)行低磷脅迫下的培養(yǎng)并開始取樣。取樣時分別剪下植株的根和葉，用液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1RNA提取及反轉(zhuǎn)錄材料總RNA的提取使用TaKaRa公司的RNAiso Plus，按照說明書提供的方法進(jìn)行，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并使用Thermo NanoDrop 1 000核酸蛋白檢測儀檢測RNA濃度。用于克隆的cDNA第一鏈的合成使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，按照說明書方法進(jìn)行；用于表達(dá)模式分析的cDNA的合成使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，按照說明書所提供方法進(jìn)行。

1.2.2小麥TaD27基因克隆以O(shè)sD27基因序列為參考，在NCBI上使用Blast工具搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫，將得到的高度同源序列進(jìn)行甄別和拼接。以拼接后序列為模板設(shè)計PCR特異引物TaD27-f(5′-AGGCCATAAACATGGAGGCCACCGCA-3′)和TaD27-r(5′-GCTAGCAATTCACACCAT AGTCCTGCTTCGCG-3′)。以合成的cDNA第一鏈為模板，使用TaKaRa公司的高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GC Buffer進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收后連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10菌株。挑取陽性克隆送至上海立菲生物技術(shù)有限公司(北京)進(jìn)行測序。

1.2.3TaD27表達(dá)分析采用實時熒光定量RT-PCR的方法探究TaD27在不同組織及不同時間低磷脅迫條件下的表達(dá)模式。根據(jù)TaD27測序后的序列，使用Beacon Designer 8設(shè)計RT-PCR引物TaD27-qf(5′- GGCTACCAAGGATTAATAGA-3′)和TaD27-qr(5′-ATCATCACCTTTATCATTGTG-3′)。以小麥β-actin基因為內(nèi)參，其引物為TaActin-qf(5′-GACCTCACGGATAATCTAATG-3′)和TaActin-qr(5′-ACCATCAGGCATCTCATAG-3′)。RT-PCR反應(yīng)使用TaKaRa公司的SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒，按照說明書所提供方法在Bio-Rad CFX96實時定量PCR儀上進(jìn)行。

1.2.4TaD27基因染色體定位及其蛋白序列比對和進(jìn)化關(guān)系分析利用克隆獲得的TaD27基因序列搜素小麥單條染色體survey sequence(http://

www.wheatgenome.org/)，獲得其同源序列以及各同源序列在染色體上的定位信息。下載同源序列，使用spidey軟件比對基因組和cDNA序列，獲得基因結(jié)構(gòu)信息。多序列比對和進(jìn)化樹的構(gòu)建利用MEGA 6完成。進(jìn)化樹構(gòu)建使用Neibor-joining算法，并使用Bootstrap方法進(jìn)行檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1小麥TaD27基因克隆及序列分析

提取小麥根組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后使用特異引物擴(kuò)增，獲得TaD27 cDNA片段，大小約為800 bp，與預(yù)期大小相符(圖1)。目標(biāo)片段連接至克隆載體進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，該基因包含2個高度相似的同源序列( GeneBank編號為KX168420和KX168421)。用兩者分別搜索小麥每一個染色體臂的篩查序列，結(jié)果顯示，兩者分別定位于7AL和7DL上的重疊群chr7AL_4558620和 chr7DL_3370387。另外發(fā)現(xiàn)，7BL重疊群chr7BL_6654524上存在另一個D27同源基因。將上述3個同源基因分別命名為TaD27-7AL、TaD27-7BL和TaD27-7DL?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，3個TaD27基因序列及結(jié)構(gòu)高度一致，均包含7個外顯子，編碼區(qū)長度分別為828 bp(7AL)、840 bp(7BL)和843 bp(7DL)。三者基因結(jié)構(gòu)與二穗短柄草、水稻等單子葉植物高度一致(表1)。

3種小麥D27蛋白序列比對結(jié)果如圖2所示，三者的序列極度一致，尤其是TaD27-7BL和TaD27-7DL，它們之間僅有2個氨基酸殘基的差異。

M. NEB 100 bp DNA ladder；1.TaD27 cDNA圖1　TaD27 cDNA瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1　Agarose gel electrophoresis of TaD27 cDNA

基因名稱Genename每個外顯子長度LengthofeachExon/bpExon1Exon2Exon3Exon4Exon5Exon6Exon7TaD27-7AL32114093621079432TaD27-7BL32414093621079432TaD27-7DL32714093621079432BdD2730714093621079035OsD2730414093621079041

三者N-末端均包含一段葉綠體轉(zhuǎn)運肽，該部分保守性稍低。結(jié)構(gòu)域分析顯示，TaD27中包含一個功能未知的DUF4033結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域位于TaD27-7AL序列的175～256之間。

2.2小麥TaD27系統(tǒng)發(fā)育分析

用MEGA6軟件對來自不同植物的D27蛋白進(jìn)行比對后構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示(圖3)，D27蛋白主要分布于3個相對獨立進(jìn)化枝中，小麥、二穗短柄草、水稻、玉米等單子葉植物處于同一相對獨立進(jìn)化分枝中；苜蓿、蘋果、番茄、葡萄等雙子葉植物處于同一相對獨立的進(jìn)化枝中；藻類則處于單獨的一個進(jìn)化枝中。小麥的TaD27與粗山羊草、烏拉爾圖小麥、大麥的親緣關(guān)系最近，其中TaD27-7AL與烏拉爾圖小麥和大麥親緣最近，TaD27-7BL、TaD27-7DL與粗山羊草親緣相近，這符合小麥異源六倍體的進(jìn)化歷史，即A基因組來源于烏拉爾圖小麥，D基因組來源于粗山羊草，B基因組來源于擬斯卑爾脫山羊草的近親。

圖2　小麥TaD27同源蛋白的比對Fig. 2　Alignment of wheat TaD27 homologous proteins

圖中分支點的數(shù)字表示基于500次重復(fù)該節(jié)點的自展支持率；標(biāo)尺代表遺傳距離圖3　小麥TaD27基因的系統(tǒng)發(fā)育分析The figures at the nodes show the bootstrap values based on 500 replications, and the scale represents the genetic distanceFig. 3　Phylogenetic analysis of wheat TaD27

圖4　小麥TaD27基因在不同組織(A)和低磷脅迫(B)下的表達(dá)模式Fig. 4　Expression pattern of wheat TaD27 in different tissues (A) and under low phosphate stress (B)

2.3小麥TaD27基因在不同組織和低磷脅迫下的表達(dá)

使用熒光定量PCR法檢測TaD27基因在不同組織中的表達(dá)水平以及低磷脅迫對其表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，TaD27基因在葉、葉鞘和莖等地上營養(yǎng)組織中表達(dá)量最高，在幼穗中的表達(dá)量較低，在根中的表達(dá)量最低，只有葉中表達(dá)量的約1/27(圖4，A)。當(dāng)植株受到低磷脅迫時，TaD27在根中的表達(dá)量會先下降，在脅迫3～6 h時表達(dá)量降到未受脅迫時的1/3左右，隨后，其表達(dá)量又會逐漸恢復(fù)，在96 h時基本恢復(fù)到未受脅迫時的表達(dá)量(圖4，B)。與根的情況不同的是，葉中TaD27在低磷脅迫條件下的表達(dá)量會先輕微上調(diào)，在6 h時達(dá)到峰值，然后表達(dá)量又會下降，脅迫至96 h時，表達(dá)量只有初始的一半左右(圖4，B)。

3　討　論

本研究以水稻OsD27基因為參考，同源克隆了小麥TaD27基因。染色體定位表明在小麥7A、7B、7D染色體長臂上各有1個TaD27基因座位?；虻慕Y(jié)構(gòu)分析表明，3種小麥編碼區(qū)均由7個外顯子組成，除了第一個外顯子外，其余幾個長度完全一致，這種基因結(jié)構(gòu)與二穗短柄草、水稻等單子葉植物也非常一致，說明它們是從共同祖先進(jìn)化而來。TaD27基因編碼的氨基酸序列前端包含1個45個氨基酸殘基左右的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，這與模式植物水稻和擬南芥D27的研究事實相符。所有植物D27蛋白后端均包含一個DUF4033結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域應(yīng)該與其催化類胡蘿卜素異構(gòu)的功能直接相關(guān)，但該結(jié)構(gòu)域如何實現(xiàn)功能，需要更深入的研究。

以前的觀點認(rèn)為SLs應(yīng)該主要是在根中合成，然后運輸?shù)狡渌课话l(fā)揮作用，然而筆者發(fā)現(xiàn)，TaD27在植株地上部分(葉、葉鞘和莖)的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在根中的表達(dá)量。前人分別對水稻D27和擬南芥D27在不同組織中的表達(dá)量做過研究，均發(fā)現(xiàn)D27在根中的相對表達(dá)量并不高[7-8]。近些年，2種新的調(diào)控D27基因表達(dá)的GRAS型轉(zhuǎn)錄因子NSP1和NSP2的發(fā)現(xiàn)表明，可能存在一種通過控制D27基因的表達(dá)量來調(diào)控SLs合成量的信號途徑[13]，這種信號途徑可能無需SLs的跨組織運輸即可完成對外部環(huán)境刺激的應(yīng)答。還有研究發(fā)現(xiàn)，根對外部礦物營養(yǎng)的響應(yīng)策略取決于其是否依賴外部的叢生菌根真菌(AM)提供的礦物營養(yǎng)，這導(dǎo)致有根瘤固氮的紅三葉草(TrifoliumrepensLinn)[14]、無根瘤固氮但依賴AM共生的高粱[12]和不依賴AM共生的白羽扇豆(Lupinusalbus)[15]受到低磷脅迫時采取了不同的SL合成策略。由此，筆者推測，根受到外部營養(yǎng)匱乏信號刺激時SLs的大量合成主要用于分泌并誘導(dǎo)共生的AM的分枝來獲得更多的礦物營養(yǎng)，而不是向上運輸，抑制分枝的SLs可能來自于地上組織，這也與植株根部D27基因的表達(dá)量相對于地上部分更低的事實相符。

在本研究中，TaD27在低磷脅迫下的表達(dá)在根中和葉中呈現(xiàn)不同的模式，在根中的表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)，而葉中卻是先上調(diào)后下調(diào)，筆者推斷，這可能與這兩種組織營養(yǎng)儲備狀況相關(guān)。當(dāng)受到低磷脅迫時，根和葉都要做出提高SLs合成量的響應(yīng)，但根中相對較小的營養(yǎng)物質(zhì)儲存量造成TaD27表達(dá)會短時下調(diào)，當(dāng)營養(yǎng)狀況通過跨組織運輸?shù)玫礁纳坪螅浔磉_(dá)量又開始上升；而葉由于營養(yǎng)儲備豐富，因此可以短時內(nèi)增加TaD27表達(dá)量，當(dāng)SLs積累后，通過負(fù)反饋作用抑制自身的繼續(xù)合成，因此TaD27表達(dá)量又開始下調(diào)。本研究中所取的低磷脅迫的時間范圍內(nèi)，TaD27的表達(dá)量變化不大，未來的研究中應(yīng)該增加脅迫時間，以期看到其表達(dá)量隨低磷脅迫時間變化的全貌。同時，關(guān)于根部的“低磷信號”是如何傳導(dǎo)至地上部分并調(diào)控其SLs合成途徑的問題尚待解決。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning, Mapping and Expression Analysis of β-carotene Isomerase Encoding Genes in Wheat (TriticumaestivumL.)

ZHANG Peng1, JIA Xiao1, DENG Shuai1, SHAN Liwei2, FAN Sanhong1*

(1 College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling， Shaanxi 712100, China; 2 College of Science, Northwest A&F University, Yangling， Shaanxi 712100, China)

β-carotene isomerase (D27) is the first enzyme involved in strigolactones biosynthesis. In this study, the cDNAs encoding β-carotene isomerase (TaD27) were cloned from wheat cultivar Chinese Spring by RT-PCR. Further, their expression in different tissues and under low phosphate stress were analysed by Real-time Quantitative PCR. The result showed that: (1) TwoTaD27 cDNAs were cloned, which was maped on the long arms of 7A and 7D chromosome, respectively (namedTaD27-7ALandTaD27-7DL). In addition, we found another locus located on chromosome 7BL encoding the third homolog (TaD27-7BL) by sequence analysis. (2) Each of the threeTaD27s contains 7 exons composing an ORF of 828 bp (7AL), 840 bp(7BL) or 843 bp (7DL), respectively and encodes a protein containing a chloroplast transit peptide at N-terminal. Phylogenetic analyses indicated that D27s in plants clustered into three independent clades. TaD27s share a high level of identity with orthologs in other monocots such asOryzasativaandZeamays, as a result, they are clustered in the same clade. (3) The expression level ofTaD27 is relatively high in leaves, sheaths and stems, lower in young panicles, and lowest in roots. Under low phosphate stress the expression ofTaD27 in roots is down regulated to the bottom in 6-12 h firstly, and then it rises to the normal level after 96 h. On the contrary, the expression ofTaD27 in leaves is up regulated in early stage and the peak is at 6h, then it continuously drops to a relatively low point at 96 h.

wheat;D27; chromosomal localization; gene structure; expression pattern

1000-4025(2016)07-1315-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1315

2016-04-29;修改稿收到日期:2016-05-26

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(2014YB032)

張朋(1988-)，男，在讀碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: 1010178322@qq.com

范三紅，博士，副教授，主要從事分子生物學(xué)及生物信息學(xué)研究。E-mail: shfan@nwsuaf.edu.cn

Q785；Q786

A