翟　瑩，張　軍，楊曉杰，趙　艷，陳　陽

(1 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2 黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161005)

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大豆SbPRP3基因表達(dá)及轉(zhuǎn)基因煙草非生物脅迫鑒定

翟瑩1，張軍2，楊曉杰1，趙艷1，陳陽1

(1 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2 黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161005)

為研究大豆(GlycinemaxL.)細(xì)胞壁脯氨酸富集蛋白基因(SbPRP3)在逆境脅迫中的作用，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)SbPRP3在高鹽、干旱和低溫處理下的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，SbPRP3在高鹽處理下表達(dá)量升高，在干旱和低溫處理下表達(dá)量先升高后降低。將SbPRP3構(gòu)建到植物表達(dá)載體pRI101-AN上并轉(zhuǎn)化煙草，獲得陽性轉(zhuǎn)基因煙草3株。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行高鹽、干旱和低溫脅迫處理。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，高鹽和低溫處理下轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸積累量增加，而丙二醛產(chǎn)生量降低。但干旱處理后轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸和丙二醛的含量與對(duì)照相比沒有顯著差異。由此推測(cè)SbPRP3可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性和耐寒性。

大豆；脯氨酸富集蛋白；SbPRP3；表達(dá)分析；抗逆性

植物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)在細(xì)胞發(fā)育及應(yīng)對(duì)不良環(huán)境因子時(shí)會(huì)發(fā)生變化。這些變化包括細(xì)胞壁中多糖(例如纖維素、果膠和半纖維素)以及結(jié)構(gòu)蛋白含量的改變[1]。結(jié)構(gòu)蛋白含量占植物細(xì)胞壁干重的10%左右，這些蛋白主要分為5類：富含羥脯氨酸糖蛋白(hydroxyprolin-rich glycoproteins, HRGPs)、茄科凝集素(Solanaceous lectins)、阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGPs)、甘氨酸富集蛋白(glycine-rich proteins, GRPs)和脯氨酸富集蛋白(proline-rich proteins, PRPs)[2-3]。PRPs是一類廣泛分布于植物中的富含脯氨酸和羥脯氨酸的蛋白質(zhì)。自1985年首次在傷害誘導(dǎo)的蘿卜中被發(fā)現(xiàn)后，目前已在大豆、棉花、小麥和玉米等多種植物中發(fā)現(xiàn)PRPs的存在[4-7]。

研究表明，PRPs基因的表達(dá)通常受病原菌侵染、激素、傷害、低溫、干旱和高鹽脅迫等因素的影響[2]。例如，傷害、高溫、紫外線照射和干旱等都可以誘導(dǎo)菜豆脯氨酸富集蛋白基因PvSR1的表達(dá)[8]；冷脅迫可以誘導(dǎo)棉花中GhHyPRP4的表達(dá)[6]；低溫可以誘導(dǎo)油菜BnPRP的表達(dá)，而高溫、干旱和傷害則不影響其表達(dá)[9]。大豆中的2個(gè)PRPs基因，SbPRP和GmPRP均可被多種生物及非生物因子誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，GmPRP可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性[3,10-11]。相反，芝麻SiPRP和海島棉GbHyPRP1則受病菌誘導(dǎo)后下調(diào)表達(dá)[12-13]。這些結(jié)果表明，PRPs在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。

從大豆中最早分離出的3個(gè)PRPs基因：SbPRP1、SbPRP2和SbPRP3[5,14]。其中，SbPRP1主要在成熟的下胚軸、根部和未成熟胚種皮中表達(dá)，SbPRP2主要在下胚軸頂端表達(dá)，而SbPRP3則主要在葉片中表達(dá)，表明這3個(gè)基因表達(dá)具有明顯的發(fā)育階段特異性和組織特異性。但有關(guān)這3個(gè)基因在逆境條件下的表達(dá)情況及在大豆抗逆中發(fā)揮的作用并未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆SbPRP3基因在高鹽、干旱和低溫處理下的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并將其轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行抗性鑒定，為后續(xù)SbPRP3在抗逆育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及處理

大豆(GlycinemaxL.)品種‘合豐46’由齊齊哈爾大學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室保存。將四葉期大豆幼苗置于含有200 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)液中進(jìn)行高鹽處理；置于含有20% PEG8000的MS培養(yǎng)液中進(jìn)行模擬干旱處理；置于4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理。分別處理0、1、2、5、10和24 h后取樣，剪取葉片迅速置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1總RNA提取與cDNA 合成采用Plant RNAzol試劑(鼎國(guó)公司)提取大豆不同處理時(shí)間點(diǎn)葉片的總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒(鼎國(guó)公司)說明書合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析根據(jù)SbPRP3基因序列(GenBank登錄號(hào)J05209)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物YF(5′-GGCTTCCTTTGTATCCTTCCTA-3′)和 YR(5′-ATGGGTGTTGTCCTCTACTGG-3′)。在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀上，以大豆組成型表達(dá)基因β-Tubuin(GenBank登錄號(hào)GMU12286)作為內(nèi)參基因，引物為TF(5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′)和 TR(5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′)，以大豆不同處理時(shí)間點(diǎn)葉片cDNA為模板。反應(yīng)體系為2×SYBR Premix ExTaq(TaKaRa公司)10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、cDNA 2 μL、正反向引物各 0.4 μL，雙蒸水補(bǔ)至總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性 20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。各處理均做3次重復(fù)，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果利用BIO-RAD CFX Manager軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3植物表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)SbPRP3基因序列設(shè)計(jì)引物JF(5′-ACGCGTCGACATGGCTTCCTTTGTATCCTTCC-3′)和JR(5′-GGAATTCGCTTGCTTTAGGCATGGGTG-3′，下劃線分別代表SalⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，從大豆葉片cDNA中擴(kuò)增SbPRP3基因全長(zhǎng)序列(退火溫度59 ℃)。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后連接至pMD-18T載體上，送上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序正確后，將目的基因連接到pRI101-AN植物表達(dá)載體上。重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒雙酶切鑒定后采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。

1.2.4煙草轉(zhuǎn)化用含有植物表達(dá)載體pRI101-SbPRP3的農(nóng)桿菌菌液經(jīng)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89[15]，MS培養(yǎng)基中卡那霉素篩選濃度為50 mg/L。以具有卡那霉素抗性的煙草轉(zhuǎn)化幼苗葉片cDNA為模板，pRI101-SbPRP3質(zhì)粒為陽性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因煙草葉片cDNA為陰性對(duì)照，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR鑒定。單株收獲T0代呈陽性植株的種子，將其繼續(xù)在含有30 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，獲得T1代抗性植株。繼續(xù)對(duì)T1代抗性植株葉片進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，獲得T1代陽性轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.5轉(zhuǎn)基因煙草非生物脅迫處理選取T1代中RT-PCR目的條帶最亮的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行非生物脅迫抗性鑒定。將正常生長(zhǎng)于花盆中6周齡野生型煙草和T1代轉(zhuǎn)基因煙草用400 mmol/L NaCl水溶液澆透，處理5 h，進(jìn)行鹽脅迫處理；停止?jié)菜?0 d，進(jìn)行干旱脅迫處理；煙草連同花盆一起置于4 ℃培養(yǎng)箱中12 h，進(jìn)行冷脅迫處理。每個(gè)處理3次重復(fù)。脯氨酸含量測(cè)定采用Bates等[16]的方法。丙二醛含量測(cè)定采用Shao等[17]的方法。

2　結(jié)果與分析

2.1逆境脅迫下 SbPRP3基因表達(dá)分析

為研究SbPRP3在大豆逆境脅迫過程中的功能，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大豆葉片中SbPRP3在高鹽、干旱和低溫處理下的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖1)，高鹽處理后，SbPRP3表達(dá)量升高，在處理24 h達(dá)到最大值，是對(duì)照的12倍。PEG8000模擬干旱處理后，SbPRP3表達(dá)量在1 h迅速升高，是對(duì)照的13倍，之后又迅速下降并一直低于對(duì)照。低溫處理后，SbPRP3表達(dá)量在1 h達(dá)到最高，是對(duì)照的35倍，之后逐漸降低，到24 h表達(dá)量已恢復(fù)到對(duì)照水平。

圖1　SbPRP3在逆境處理下的表達(dá)Fig. 1　Expression of SbPRP3 with different stress treatments

2.2植物表達(dá)載體的構(gòu)建

通過RT-PCR從大豆葉片中擴(kuò)增出273 bp的SbPRP3基因全序列(圖2)。將SbPRP3構(gòu)建到植物表達(dá)載體pRI101-AN上，經(jīng)質(zhì)粒雙酶切鑒定(圖2)，酶切條帶與期望值一致，說明目的基因已整合進(jìn)植物表達(dá)載體中。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105即獲得轉(zhuǎn)基因工程菌。

2.3轉(zhuǎn)基因煙草的篩選

取無菌條件下培養(yǎng)的煙草葉片進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。待抗性芽生長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)(圖3，A)，將其從愈傷組織中分離并轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中。約4～5周抗性芽長(zhǎng)出根系并逐漸成苗(圖3，B、C)。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)(圖4)，共獲得SbPRP3陽性轉(zhuǎn)基因煙草3株。

2.4轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性鑒定

脯氨酸測(cè)定結(jié)果顯示(圖5，A)，正常條件下，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量沒有顯著差別。當(dāng)鹽脅迫處理5 h時(shí)，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量都明顯升高，但轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量極顯著高于野生型煙草；丙二醛測(cè)定結(jié)果顯示(圖5，B)，正常條件下，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛含量沒有顯著差別。當(dāng)鹽脅迫處理5 h時(shí)，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛含量都有所升高，但轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛含量顯著低于野生型煙草。以上結(jié)果表明SbPRP3可以提高轉(zhuǎn)基因煙草植株在高鹽脅迫下脯氨酸的積累，降低丙二醛的產(chǎn)生，提高煙草耐鹽性。

M. DL2000; 1. SbPRP3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; 2. SbPRP3質(zhì)粒雙酶切圖2　SbPRP3 PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒雙酶切結(jié)果M. DL2000; 1. PCR products of SbPRP3; 2. Products of SbPRP3 plasmid double digestionFig. 2　PCR products and plasmid double digestion of SbPRP3

圖3　SbPRP3轉(zhuǎn)基因煙草植株篩選Fig. 3　Screening of SbPRP3 transgenic tobacco

M. DL2000; 1、5. 野生型煙草; 2～4. 轉(zhuǎn)基因煙草; 6. 陽性質(zhì)粒圖4　SbPRP3轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果M. DL2000; 1,5. Wild type tobacco; 2-4. Transgenic tobacco; 6. Positive plasmidFig. 4　RT-PCR detection resu1ts of SbPRP3 transgenic tobacco

WT. 野生型煙草; **和*分別表示在1%和5%概率水平上差異顯著; 下同圖5　SbPRP3轉(zhuǎn)基因煙草鹽處理5 h的葉片脯氨酸和丙二醛含量WT. Wild type tobacco; ** and * indicate significant difference at P < 0.01 and P < 0.05 respectively; The same as belowFig. 5　Proline and malondialdehyde contents of SbPRP3 transgenic tobacco plants after salt treatment for 5 h

2.5轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性比較

脯氨酸測(cè)定結(jié)果顯示(圖6，A)，當(dāng)停止?jié)菜?0 d時(shí)，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量都明顯升高，轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量與野生型煙草沒有顯著差異；丙二醛測(cè)定結(jié)果顯示(圖6，B)，當(dāng)停止?jié)菜?0 d時(shí)，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛含量都明顯升高，轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛含量與野生型煙草沒有顯著差異。以上結(jié)果表明SbPRP3對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性沒有顯著影響。

圖6　SbPRP3轉(zhuǎn)基因煙草干旱處理10 d的葉片脯氨酸和丙二醛含量Fig. 6　Proline and malondialdehyde contents of SbPRP3 transgenic tobacco plants after drought treatment for 10 d

2.6轉(zhuǎn)基因煙草耐寒性比較

脯氨酸測(cè)定結(jié)果顯示(圖7，A)，當(dāng)?shù)蜏孛{迫處理12 h時(shí)，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量都明顯升高，但轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量顯著高于野生型煙草；丙二醛測(cè)定結(jié)果顯示(圖7，B)，當(dāng)?shù)蜏孛{迫處理12 h時(shí)，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛含量都有所升高，但轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛含量顯著低于野生型煙草。以上結(jié)果表明SbPRP3可以提高轉(zhuǎn)基因煙草植株在低溫脅迫下脯氨酸的積累，降低丙二醛的產(chǎn)生，提高煙草耐寒性。

3　討　論

植物細(xì)胞壁直接與外界接觸，一旦植物遭受逆境時(shí)，首先需要細(xì)胞壁的一系列變化適應(yīng)這些不利環(huán)境，因此可以預(yù)見植物細(xì)胞壁蛋白可能在植物抗逆中發(fā)揮重要作用。研究表明，PRPs基因的過量表達(dá)能夠提高植物葉片的木質(zhì)化程度，使細(xì)胞壁變厚，因而在細(xì)胞壁的建造和細(xì)胞的防御過程中發(fā)揮重要作用[18-19]。Deutch等認(rèn)為，PRPs可能通過蛋白的雙功能域在細(xì)胞壁和膜之間起牢固的連接作用，來確保細(xì)胞的完整性，從而提高植物抗性[9, 20]。例如，水稻細(xì)胞壁蛋白OsPRP3基因的超表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗冷性[21]；木豆CcHyPRP基因在擬南芥中超表達(dá)可以提高擬南芥的對(duì)干旱、高鹽和高溫的抵抗能力[22]。相反，將擬南芥中編碼HyPRP的EARLI1基因敲除后，突變植株的細(xì)胞在冷脅迫下更易受到破壞[23]。同樣將擬南芥中的另一個(gè)編碼PRP的SICKLE(SIC)基因敲除后，突變植株與正常擬南芥相比對(duì)冷和鹽脅迫更加敏感[24]。

本研究對(duì)大豆中較早克隆的細(xì)胞壁脯氨酸富集蛋白基因SbPRP3進(jìn)行逆境處理表達(dá)分析，結(jié)果顯示高鹽、干旱和低溫處理均能不同程度地誘導(dǎo)SbPRP3的表達(dá)，但響應(yīng)模式不完全一致。高鹽處理24 h內(nèi)SbPRP3的表達(dá)量一直升高，而干旱和低溫處理后，SbPRP3的表達(dá)量先升高后降低。前人也有類似的研究結(jié)果，油菜BnPRP基因能夠被低溫誘導(dǎo)表達(dá)，而干旱、高溫和傷害則不影響其表達(dá)[9]。擬南芥中的PRP4、PRP11和PRP16能夠被線蟲感染誘導(dǎo)表達(dá)，而PRP9和PRP10則能夠被假單胞菌侵染所誘導(dǎo)[25]。大豆SbPRP基因能夠被干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而脫落酸、激動(dòng)素和茉莉酸甲酯則抑制其表達(dá)[10]。由此推測(cè)SbPRP3可能在大豆應(yīng)對(duì)不同的脅迫過程中發(fā)揮不同的作用。

鑒于SbPRP3可能在大豆應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)發(fā)揮功能，我們將其導(dǎo)入煙草中并對(duì)相關(guān)逆境生理指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。保持水分、維持滲透調(diào)節(jié)、降低植株細(xì)胞膜損傷是植物抵抗非生物脅迫的幾個(gè)關(guān)鍵因素。本研究表明SbPRP3在轉(zhuǎn)基因煙草中通過提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的含量以及降低細(xì)胞膜的損傷可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性和耐寒性，但對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性沒有顯著影響。這可能與SbPRP3對(duì)不同脅迫的響應(yīng)模式不一致有關(guān)，因?yàn)槟M干旱處理后，SbPRP3的表達(dá)量?jī)H在1 h時(shí)高于對(duì)照，之后一直低于對(duì)照。正如前人所說，某些條件下脅迫基因表達(dá)水平的上調(diào)可能不足以提高對(duì)脅迫的抗性[26]。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入探討大豆細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白中脯氨酸富集蛋白的抗逆機(jī)制及應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Expression ofSbPRP3 in Soybean and Resistance Ability in Transgenic Tobacco to Abiotic Stress

ZHAI Ying1, ZHANG Jun2, YANG Xiaojie1, ZHAO Yan1, CHEN Yang1

(1 College of Life Science and Agro-Forestry, Qiqihar Univesity, Qiqihar, Heilongjiang 161006, China; 2 Heilongjiang Institute of Veterinary Science, Qiqihar, Heilongjiang 161005, China)

Plant proline-rich proteins (PRPs) are putative cell wall proteins, which are usually associated with different abiotic stresses. The expression ofSbPRP3 under abiotic stress treatments in soybean was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The expression ofSbPRP3 increased under salt treatment, while it increased firstly and thereafter declined under drought and cold treatments. Furthermore，the ORF ofSbPRP3 was cloned into the plant expression vector of pRI101-AN and then introduced into tobacco by Agrobacterium-mediated transformation. Three positive transgenic tobacco plants were obtained. The transgenic tobacco plants were treated with salt, drought and cold stresses. The results showed that the transgenic plants maintained higher levels of proline and lower level of malondialdehyde compared to wild-type plants under salt and cold stresses. While the levels of proline and malondialdehyde in transgenic plants had no significant differences compared to wild-type plants under drought stress. These data indicated that the transgenic tobacco plants constitutively expressingSbPRP3 showed an increased tolerance to salt and cold compared to wild-type plants.

soybean; proline-rich protein;SbPRP3; expression analysis; stress tolerance

1000-4025(2016)07-1331-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1331

2016-04-04;修改稿收到日期:2016-05-16

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541889)

翟瑩(1982-)，女，博士，講師，主要從事大豆分子育種研究。E-mail：fairy39809079@126.com

Q785;Q786

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