苑藝?yán)?，汪　娜，王洪玉，盧　芳，劉樹民

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱150040；2.黑龍江省高等院校中藥基本理論研究科技創(chuàng)新團(tuán)隊，哈爾濱150040；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，齊齊哈爾161000）

黃芩鎮(zhèn)靜作用有效組分的篩選

苑藝?yán)?，2，汪娜3，王洪玉1，2，盧芳1，2，劉樹民1，2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，哈爾濱150040；2.黑龍江省高等院校中藥基本理論研究科技創(chuàng)新團(tuán)隊，哈爾濱150040；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，齊齊哈爾161000）

篩選出黃芩中具有鎮(zhèn)靜作用的有效組分.昆明種小鼠分為D101 30組、D101 95組、黃芩多糖組、黃芩揮發(fā)油組以及黃芩高低劑量組六組，觀察對小鼠自主活動的影響，戊巴比妥鈉域上、域下劑量致小鼠入睡的影響，并運用聚類分析的統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的處理分類.通過各有效組分與空白組比較以及分層聚類分析的數(shù)據(jù)處理方法，得出黃芩D101 30組和D101 95組具有顯著性鎮(zhèn)靜作用.黃芩D101 30和D101 95組分具有更為顯著的鎮(zhèn)靜作用.

黃芩；鎮(zhèn)靜；有效部位；聚類分析

黃芩為唇形科植物Scutellaria baicalensis Georg的干燥根，《中國藥典》中記述“黃芩苦寒，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效［1］.黃芩在古代醫(yī)學(xué)典籍中，并未有明確的鎮(zhèn)靜安神功效的記載，但其在配伍中常與治療清熱安神和疏肝安神等的方書中使用，對治療鎮(zhèn)靜安神、清熱解毒和肝郁火型失眠均有一定的治療效果［2-3］.在現(xiàn)代藥理學(xué)的研究中表明，黃芩苷具有一定的清熱鎮(zhèn)靜的作用［4-5］.而黃芩的各有效組分是否具有鎮(zhèn)靜作用，卻沒有進(jìn)一步具體的分析研究，本實驗旨在對黃芩鎮(zhèn)靜作用中各組分的有效性進(jìn)行篩選，并初步探討其作用機制.

1　材料

1.1藥物

1.2動物

SPF級昆明種小鼠320只，雌雄各半，體重18 ～22 g（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)安全評價中心提供，批號SCXK黑2013-004）.

1.3儀器

KDC-160HR高速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；電子數(shù)字式溫度計MC -612型（歐姆龍有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-50B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZZ-6型自主活動儀（成都泰盟軟件有限公司），MK3型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司）等.

1.4供試藥品的制備

取黃芩500 g，超聲浸泡石油醚中，得揮發(fā)油成分；生藥第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并煎液，濃縮至適量［6］，加95%乙醇調(diào)至醇體積分?jǐn)?shù)85%，靜置24 h，濾過，精制沉淀得多糖部位.取上清液濃縮至適量，過D101大孔樹脂，分別加3倍柱體積的30%乙醇，95%乙醇洗脫，將各洗脫液濃縮凍干，黃芩的全部成分拆分為4個組分：即脂肪油組分，提取率為2.62%、多糖組分、D101 30醇組分和D101 95組分（主要為苷元類）.多糖組分主要含有黃芩多糖，提取率為27.94%；D101 30醇組分主要含有黃酮苷類（黃芩苷、漢黃芩苷等）和環(huán)烯醚萜類等苷類物質(zhì)，提取率為27.4%；D101 95組分主要含有黃酮苷元類（黃芩素、漢黃芩素等）等苷元類物質(zhì)，提取率為3. 48%.（見圖1）.

圖1　黃芩各拆分組分分離流程圖

2　方法

2.1對小鼠自主活動次數(shù)的影響［7］

我在那個晚上極其無聊，我先去找沈天祥，沈天祥的母親說他中午出門以后一直沒有回來，我又去找王飛，王飛躺在床上面紅耳赤，他被四十度的高熱燒得頭昏腦脹。最后我去了陳力慶的家，陳力慶正拍著桌子在和他父親吵架，我的腳都沒有跨進(jìn)陳力慶的家門，我不愿意把自己卷進(jìn)別人的爭吵之中，尤其是父子之間的爭吵。

取昆明種小鼠80只，隨機分成8組，每組10只，雌雄各半.分為空白對照組，（給予同容積的蒸餾水），地西泮組（4 mg/kg），黃芩低劑量組（3 g生藥/kg），黃芩高劑量組（12 g生藥/kg），黃芩D101 30組，黃芩D101 95組，黃芩多糖組，黃芩揮發(fā)油組，四個組分組給藥量按照低劑量組的生藥量轉(zhuǎn)換，給藥體積為1.0 mL/.每天灌胃1次，連續(xù)7 d.于末次給藥前8 h禁食，前1 h禁水，給藥30 min后將小鼠置于自主活動儀中，每只5 min，每測完一只，應(yīng)將暗箱徹底清理及擦拭，以免影響實驗結(jié)果.各組小鼠眼眶取血3 500 r/min離心10 min，取血清，測NO、NOS的濃度.

2.2對戊巴比妥鈉閾上劑量致小鼠睡眠時間的影響［8］

動物分組及給藥方法同上.于末次給藥前8 h禁食，前1 h禁水，給藥30 min后腹腔注射戊巴比妥鈉35 mg/kg，觀察并記錄各組小鼠睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時間.

2.3對戊巴比妥鈉閾下劑量致小鼠睡眠時間的影響［8］

動物分組及給藥方法同上.于末次給藥前8 h禁食，前1 h禁水，給藥30 min后腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg，觀察并記錄各組小鼠睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時間.

2.4統(tǒng)計學(xué)處理

3　結(jié)果

3.1對小鼠自主活動次數(shù)的影響

與空白組比較，各組分的活動次數(shù)減少，其中D101 95組，多糖組和黃芩高劑量組有顯著性差異（P＜0.05），D101 30組和黃芩低劑量組有極顯著性差異（P＜0.01）；各組分的站立次數(shù)減少，其中D101 30組，D101 95組和揮發(fā)油組均有顯著性差異（P＜0.05），多糖組和黃芩高劑量組有極顯著性差異（P＜0.01），表明黃芩各組分對自主活動次數(shù)有不同程度的降低的作用（見表1）.與空白組比較，其中黃芩D101 30，D101 95，多糖和黃芩高劑量組小鼠血清NO濃度有顯著性差異（P＜0.05）；黃芩D101 95和多糖組小鼠血清NOS濃度有顯著性差異（P＜0.05），黃芩高劑量組和揮發(fā)油組有極顯著性差異（P＜0.01）（見表2）.

表1　小鼠自主活動次數(shù)的比較±S，n=10）

表1　小鼠自主活動次數(shù)的比較±S，n=10）

注：與空白組比較*P＜0.05，與空白組比較＊＊P＜0.01

29.14±6.12　80.5±11.32 D101 30　15.1±4.79＊＊　69.38±8.43*D101 95　19.8±8.44*　66.4±15.3*多糖　21.2±6.7*　58.7±16.78＊＊揮發(fā)油　23.3±8.47　70.2±9.3*芩低　21.4±4.7＊＊　68.9±22芩高　19.2±8.95*　58.3±18＊＊陽性　20.57±5.91*　58.71±16.15活動次數(shù)　站立次數(shù)空白＊＊

表2　各組小鼠血清NO、NOS的比較（±S，n=10）

表2　各組小鼠血清NO、NOS的比較（±S，n=10）

注：與空白組比較*P＜0.05，與空白組比較＊＊P＜0.01

NO/（mol·L-1）　NOS/（mol·L-1）7.685±0.1　2.752±0.361 D101 30　8.722±0.998*　3.084±0.215 D101 95　8.613±0.874*　3.37±0.524*多糖　8.318±0.637*　3.124±0.343*揮發(fā)油　8.357±0.867　3.399±0.581＊＊芩低　8.265±1.044　2.961±0.525芩高　8.677±1.012*　3.444±0.588＊＊陽性　8.71±0.723＊＊　3.349±0.497空白＊＊

3.2對閾上劑量致小鼠睡眠時間的影響

與空白組比較，黃芩D101 30組、D101 95組、黃芩低劑量組、高劑量組和揮發(fā)油組的睡眠潛伏期縮短，睡眠時間明顯延長，具有顯著性和極顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），表明黃芩D101 30、D101 95、黃芩低劑量、高劑量組及揮發(fā)油組具有催眠作用（見表3）.

表3　閾上劑量戊巴比妥鈉致動物睡眠和睡眠時間的比較（±S，n=10）

表3　閾上劑量戊巴比妥鈉致動物睡眠和睡眠時間的比較（±S，n=10）

注：與空白組比較*P＜0.05，與空白組比較＊＊P＜0.01

7.24±1.09　18.01±2.8 D101 30　5.51±1.28＊＊　23.25±6.14*D101 95　5.84±1.71*　22.31±2.56＊＊多糖　6.14±2.47　15.92±9.36揮發(fā)油　4.66±2.03＊＊　16.9±6.45芩低　4.41±1.26＊＊　23.5±4.14＊＊芩高　4.77±1.09＊＊　24.28±6.93*陽性　3.75±1.56＊＊　61.85±3.89 /min空白潛伏期/min　睡眠時間＊＊

3.3對閾下劑量致小鼠睡眠時間的影響

與空白組比較，黃芩D101 30、D101 95、多糖組、黃芩低劑量組、高劑量組和揮發(fā)油組的睡眠潛伏期縮短，睡眠時間明顯延長，具有顯著性和極顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），表明黃芩D101 30、D101 95、多糖組、黃芩低劑量、高劑量組及揮發(fā)油組具有催眠作用（見表4）.

表4　閾下劑量戊巴比妥鈉致動物睡眠和睡眠時間的比較（±S，n=10）

表4　閾下劑量戊巴比妥鈉致動物睡眠和睡眠時間的比較（±S，n=10）

注：與空白組比較*P＜0.05，與空白組比較＊＊P＜0.01

12.13±2.87　6.62±6.1 D101 30　7.99±3.47＊＊　13.73±2.76*D101 95　11.98±0.84　27.971±17.41＊＊多糖　9.64±4.35　17.31±13.08*揮發(fā)油　8.61±3.22*　10.55±5.68芩低　8.52±2.61＊＊　20.09±4.35*芩高　7.7±3.61＊＊　15.64±10.94*陽性　7.66±2.16＊＊　17.1±5.86 /min空白潛伏期/min　睡眠時間＊＊

4　分層聚類分法對鎮(zhèn)靜睡眠各有效組分進(jìn)行歸納處理

通過對表1～4的數(shù)據(jù)分析結(jié)果觀察到，黃芩的各個有效組分均有一定程度的鎮(zhèn)靜睡眠作用，這對于篩選有效組分存在一定的局限性，也不易于進(jìn)一步的分析［9］，因此，本實驗大膽的采用聚類分析的處理方法，將各組分進(jìn)行歸類分析，以達(dá)到有效組分篩選的目的.

本實驗采用的是分層聚類分析法，其檢測結(jié)果見圖2、表5.將各組分依次從空白、D101 30、D101 95、多糖、揮發(fā)油、芩低、芩高和陽性組分按1～8號排序，從圖2中可以看出，黃芩各有效組分一共8組，可聚成3大類，樣品4、5、6、7號樣品間的距離最?。?～6），可歸為一類，樣品2、3、8號間的距離相近（11～15），可歸為一類，樣品1號的距離大于15，可歸為一類.由圖1可以看出，這三類樣品的距離有一定差距，因此這三類之間具有差異性.8號為陽性對照組，其對于鎮(zhèn)靜睡眠作用的效果為最佳，而2號D101 30組分和3號D101 95組分與陽性對照組在同一類，因此，可以推斷在黃芩干預(yù)鎮(zhèn)靜睡眠的藥理作用中，D101 30組分和D101 95組分的治療效果最佳.

表5　分層聚類分析詳細(xì)步驟

圖2　分層聚類分析樹狀圖

5　討論

本實驗結(jié)果表明，黃芩的各有效組分，均有不同程度的鎮(zhèn)靜作用.在鎮(zhèn)靜試驗中，通過對NO、NOS濃度的測定，初步探討黃芩各有效組分的作用機制.NO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與包括學(xué)習(xí)、記憶在內(nèi)的多種生理過程［10］.實驗研究表明NO是血管細(xì)胞中的一氧化氮合酶利用L-精氨酸合成的一種強效擴血管物質(zhì)，能快速彌散進(jìn)入平滑肌細(xì)胞，引起血管松弛［11］.實驗結(jié)果顯示，黃芩的D101 30、D101 95、多糖組、揮發(fā)油組、高劑量組等顯著提高NO、NOS的濃度，表明上述組分可能對血管擴張有一定的促進(jìn)作用，從而起到一定的鎮(zhèn)靜作用.

由于在上述實驗中，各組分的均有不同程度的差異性，因此，通過分層聚類分析的處理方法，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析處理，可以得出D101 30 和D101 95組分的鎮(zhèn)靜作用最為顯著，從圖1可以看出，這兩個組分是相對獨立的，成分是具有明顯差異性的，但都具有明顯的鎮(zhèn)靜作用，造成這一現(xiàn)象的原因可推斷為，推論1：在提取分離的時候，存在成分交叉的可能，即存在相同的化合物，這種化合物對鎮(zhèn)靜作用最為顯著；推論2：黃芩中主要成分為黃酮類化合物，但在本實驗中起到鎮(zhèn)靜作用的可能為未知化合物，是否存在及其是否對鎮(zhèn)靜有一定功效都有待日后的進(jìn)一步研究；推論3：黃芩的D101 30部位的主要成分為黃芩苷類，而D101 95部位的主要成分為黃芩苷元類，有文獻(xiàn)記載，黃芩苷類進(jìn)入體內(nèi)可以與葡萄糖醛酸結(jié)合生成苷元，而苷元在體內(nèi)亦可脫去葡萄糖醛酸而水解得到黃芩苷類化合物，其在體內(nèi)后的變化是可逆的，由此可推斷，D101 30和D101 95組分，雖然前者為水溶性的，后者為脂溶性的，但是也存在D101 30和D101 95組分均對鎮(zhèn)靜作用功效最為顯著的可能.

綜上所述，黃芩鎮(zhèn)靜作用的實驗中，D101 30 和D101 95兩個組分均更為顯著的治療效果，但究其原因，還有待于進(jìn)一步的探討與深入的研究.

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Selecting effective com ponent in sedative effect of Scutellaria baicalensis georgi

YUAN Yi-lei1，2，WANG Na3，WANG Hong-yu1，2，LU Fang1，2，LIU Shu-min1，2
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.Heilongjiang Province Universities of TCM Basic Theory Research and Technology Innovation Team，Harbin 150040，China；3.Qiqihar Medical College，Qiqihar 161000）

To select the effective component of Scutellaria baicalensis georgi sedating，the mice were divided into six groups，D101 30 group，D101 95 group，Scutellaria polysaccharide group，Scutellaria volatile oil group，Scutellaria low-dose group and Scutellaria highdose group.The effect on the spontaneous activity ofmice and the effect of sodium pentobarbital in high domain and low domain on sleepingwere observed.The cluster analysis statisticalmethod was used for classification of data further processing.Through the effective components and blank group and hierarchical cluster analysis，it was concluded that Scutellaria D101 30 group and D101 95 groups have significant sedative effection.The Scutellaria D101 and 30 D101 95 components have amore significant sedation.

Scutellaria baicalensis georgi；sedation；effective parts；cluster analysis

R284

A

1672-0946（2016）02-0132-04

2015-04-22.

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃973計劃（2013CB531804）

苑藝?yán)伲?989-），女，碩士，研究方向：中藥藥性理論.

劉樹民（1963-），男，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥性理論研究.