董　坤，隋文霞，姚　琳，隋美嬌，寇韓旭，馬英麗

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱150036）

桔?？筂P有效部位對TGF-β1 mRNA表達的影響

董坤1，隋文霞1，姚琳2，隋美嬌2，寇韓旭1，馬英麗1

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱150036）

探討桔梗抗肺炎支原體（MP）有效部位對感染大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達的影響.采用滴鼻法構(gòu)建肺炎支原體肺炎大鼠模型，用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的變化，運用RTPCR法檢測TGF-β1在空白對照組、模型對照組、阿奇霉素組、桔梗有效部位高、中、低劑量組的表達情況.結(jié)果表明，空白組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠的肺組織呈重度或中度炎癥病變，造模成功，給藥各組大鼠的肺組織病變均有所改善.模型組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA的表達量明顯增多，桔?？狗窝字гw有效部位高、中、低劑量組和陽性藥組均能下調(diào)感染MP大鼠肺組織中TGF-β1的表達，其中阿奇霉素組和桔梗有效部位高劑量組效果最佳.桔梗有效部位對MP感染致大鼠肺損傷的修復(fù)作用機制可能是通過下調(diào)TGF-β1，抑制了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程.

桔梗；肺炎支原體；TGF-β1；實時熒光定量PCR

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是由肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）感染引起的原發(fā)性非典型肺炎.目前，兒童MPP的發(fā)病率明顯增加，發(fā)病年齡逐漸提前，MP已成為小兒呼吸道感染的重要病原之一.臨床上多采用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素來治療，該類抗生素不良反應(yīng)大、副作用強，且國外已有支原體耐藥菌株報道.桔梗是一種藥食兩用的臨床常用中藥，主要用于咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛喑啞、肺癰吐膿等癥［1］.經(jīng)課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，桔梗75%乙醇提取物，經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱，以不同濃度乙醇洗脫，其50%乙醇洗脫部位具有體外抗MP的作用，MIC值為25μg/mL［2］，定為桔?？筂P的有效部位.轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）是一種多功能細胞因子，可調(diào)節(jié)細胞生長和分化，參與組織發(fā)育及損傷后修復(fù)，能誘導(dǎo)肺泡上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化［3］.研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體肺炎與TGF-β1密切相關(guān)［4］.因此本實驗采用分子生物學(xué)方法研究桔?？筂P有效部位對感染大鼠的肺組織中TGF-β1 mRNA的影響，探討其可能的作用機制.

1　實驗材料

1.1實驗動物及菌株

健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重80～100 g，實驗動物購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（吉）2011-0004.肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株（ATCCFH15531，購自美國菌種保藏中心）.

1.2藥物與試劑

桔梗飲片（安國市奉義中藥飲片有限公司，生產(chǎn)批號20130122，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為桔梗藥材）；阿奇霉素膠囊（北京四環(huán)制藥有限公司，生產(chǎn)批號20130603）.PPLO（美國BD公司），蘇木伊紅染液（南京建成生物工程研究所有限公司），無水乙醇（分析純）（天津市博迪化工有限公司），TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），Transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit （Roche公司），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche公司），大鼠TGF-β1引物：上游5'-GGCGGTGCTCGCTTTGTA-3'，下游5'-GCCACTCAGGCGTATCAG-3'，內(nèi)參β-actin：上游5' -CGTTGACATCCGTAAAGAC-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3'（哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司）.

1.3主要儀器設(shè)備

DL-CJ-1W生物凈化工作臺（北京東連哈爾儀器制造有限公司），MDF-382E-80℃低溫冰箱（日本三洋公司），Milli-Q Reference system自動雙重純水蒸餾器（MILLI-Q），2、20、200μL微量加樣器（Eppendoff公司），SorvaⅡ ST16低溫離心機（Thermo公司），Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀（Tecan公司），9600熒光定量PCR儀（杭州博日有限公司）.

2　實驗方法

2.1桔梗有效部位的提取

桔梗飲片加10倍體積75%乙醇，加熱回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液.濾液減壓回收乙醇至稠膏狀，得桔梗提取物.用AB-8大孔吸附樹脂柱對桔梗提取物進行分離，依次以4倍柱體積的水、25%、50%、75%、95%乙醇洗脫.將50%乙醇洗脫液減壓回收，即得桔梗有效部位.

2.2MP的培養(yǎng)和菌數(shù)測定

吸取1 mLMP標(biāo)準(zhǔn)菌株液加至9 mL含20%胎牛血清，10%酵母的2.1%PPLO液體培養(yǎng)基中，充分混勻后，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察.如培養(yǎng)基的顏色由紅色變?yōu)辄S色且液體澄清，則表明支原體培養(yǎng)為陽性.將待測菌液用MP培養(yǎng)基以10倍稀釋法逐管稀釋成101～1010系列濃度，經(jīng)37℃培養(yǎng)后，以發(fā)生顏色變化的最高稀釋濃度作為顏色改變單位（CCU），菌液濃度以CCU/mL 計.測得菌液濃度為106CCU/mL.

2.3分組、造模及給藥

大鼠飼養(yǎng)1周后，挑取健康者60只，按體重和性別隨機分成6組：①正常對照組；②模型組對照組；③阿奇霉素組；④桔梗有效部位高劑量組；⑤桔梗有效部位中劑量組；⑥桔梗有效部位低劑量組，每組10只，雌雄各半.腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，空白對照組滴入MP液體培養(yǎng)基，其余各組大鼠勻用含106 CCU/mLMP的培養(yǎng)基以滴鼻法［5］感染1次，每次50μL.感染后第2天，各組大鼠進行灌胃給藥.阿奇霉素組第1天劑量加倍為：32 mg·kg-1·d-1，第二天到第五天劑量：16 mg·kg-1·d-1，每日1次，共連續(xù)給藥5 d桔梗有效部位高劑量組：56 mg·kg-1·d-1，中劑量組：28 mg·kg-1·d-1，低劑量組：14 mg·kg-1·d-1，空白組和模型組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥10 d.用藥治療期間各組大鼠每日自由進食、飲水.逐日觀察其活動、進食等情況.

2.3HE染色

末次給藥1 h后，戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠.剪取左肺組織相同部位，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片在二甲苯和不同濃度乙醇中浸泡，蘇木素-伊紅染色（HE），在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織的病理改變情況.剪取右肺組織中葉，放入無RNA酶的凍存管中，-80℃保存，備用.

2.4SYBR熒光實時定量PCR

采用TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄條件：25℃10 min，50℃60 min，獲得的cDNA-20℃保存，備用.PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃復(fù)性60 s，共40個循環(huán).反應(yīng)結(jié)束儀器自動生成CT（threshold cycles）值及熔解曲線圖.每個樣本設(shè)3個重復(fù)管，同時設(shè)無模板陰性對照.

2.5統(tǒng)計學(xué)處理

采用2-ΔΔCt公式，相對定量的方法進行計算，得出TGF-β1和β-actin的相對表達量.計量數(shù)據(jù)以±S表示，運用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

圖1　各組小鼠的肺組織病理檢測（HE×40）

3　實驗結(jié)果

3.1外觀表現(xiàn)觀察

空白組大鼠皮毛光澤，呼吸平穩(wěn)，進食、活動正常；模型對照組呼吸急促不暢，大鼠鼻周見分泌物，偶有血絲，舌質(zhì)暗，肺部出現(xiàn)明顯的肺濕呼吸音，進食及活動減少；陽性藥對照組狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，未見咳嗽等呼吸系統(tǒng)癥狀；桔梗高劑量組和中劑量組，大鼠皮毛較為光澤，精神狀態(tài)較好；桔梗低劑量組大鼠活動少，進食少，大便略稀，鼻周圍可見分泌物.

3.2各組肺組織病理學(xué)改變

空白對照組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)正常，無間質(zhì)性肺炎改變，僅個別偶有淋巴樣細胞浸潤；模型對照組大鼠的肺組織呈重度或中度炎癥病變，肺泡間質(zhì)隔增寬，支氣管周圍與肺泡間隔內(nèi)毛細血管明顯充盈，淋巴細胞及個別單核細胞有不同程度浸潤現(xiàn)象，間質(zhì)呈明顯的炎癥改變，造模成功；阿奇霉素組炎癥反應(yīng)減輕，淋巴細胞和巨噬細胞浸潤減少；桔梗有效部位高劑量組間質(zhì)性炎癥減輕，與空白組相似；中劑量組少量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤在支氣管和肺血管周圍及肺泡間隔，較輕的間質(zhì)性炎癥，低劑量組仍可見間隔增寬，呈炎癥改變.見圖1.

3.3桔梗有效部位對TGF-β1 mRNA表達的影響

由表1可見，與空白對照組相比，模型組TGF -β1的mRNA的表達量明顯增多（P＜0.01）；與模型對照組相比，阿奇霉素組和桔梗有效部位高、中劑量組能顯著地降低TGF-β1的mRNA的表達（P＜0.05），低劑量組也可降低TGF-β1的mRNA的表達，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義.

表1　桔梗有效部位對TGF-β1 mRNA表達的影響（±S）

表1　桔梗有效部位對TGF-β1 mRNA表達的影響（±S）

注：與空白組比較，△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別　n　TGF-β1 10　4.10±0.36 10　1模型對照組　10　4.75±0.64△阿奇霉素組　10　2.50±0.41＊＊桔梗有效部位高劑量組　10　2.58±0.49＊＊桔梗有效部位中劑量組　10　3.60±0.73*桔梗有效部位低劑量組空白對照組

4　討論

MP是一類無細胞壁、可通過細胞過濾器、能在無生命的培養(yǎng)液中生長的最小原核細胞微生物.感染MP引發(fā)的MPP占小兒肺炎的20%左右，在密集人群可達50%.目前，MPP的發(fā)病機制并不完全清楚，主要有免疫學(xué)發(fā)病機制、呼吸道上皮細胞吸附、支原體直接侵入學(xué)說和毒素作用等學(xué)說［6］，其中免疫學(xué)方面研究較多.MP可刺激淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞等釋放多種細胞因子，TGF-β1是其中一種，這些細胞因子與肺組織損傷修復(fù)有著重要的關(guān)系.肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar epithelial cell type II，AEC II）是肺泡上皮的干細胞，呈立方形，位于肺泡角落，覆蓋約5%的肺泡表面積，是合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)的主要細胞，具有增殖分化成肺泡I型上皮細胞、肺水轉(zhuǎn)運功能及肺固有免疫等多種功能.AEC II損傷后，上皮通透性增加，肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白的合成和分泌降低，上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［7］.研究報導(dǎo)TGF-β1在AEC II發(fā)生 EMT過程中起著非常重要的作用［8-9］.TGF-β1能夠誘導(dǎo)肺泡上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，引發(fā)間質(zhì)性肺炎，嚴重者導(dǎo)致肺纖維化，作用通路與Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)［10］.TGF-β1與其受體結(jié)合后，激活受體性Smad2和Smad3，與共同通路性Smad4形成三聚體轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，其本身可作為轉(zhuǎn)錄因子，也可誘導(dǎo)一些轉(zhuǎn)錄因子，與靶基因結(jié)合，從而調(diào)節(jié)“EMT”相關(guān)基因的表達，導(dǎo)致細胞間連接分散、細胞骨架重排和細胞移行，發(fā)生EMT過程.也有研究報道TGF-β1能激活非Smad介導(dǎo)的細胞信號途徑［8］，包括 Rho、p-38MAPK、Ras、ERK、Notch、Wnt、NF-κB及PI3K途徑，參與EMT過程.葛曉娜等認為，TGF-β1能夠抑制上皮細胞增生，其表達升高可能減弱上皮細胞的再生能力，從而間接影響呼吸道的修復(fù)［11］.

中藥治療MPP的機理主要是抑制MP生長繁殖、提高機體免疫力、保護呼吸道上皮細胞等方面［12］.本研究以TGF-β1mRNA為指標(biāo)，研究桔梗有效部位抗肺炎支原體可能的作用機制，這是本課題的創(chuàng)新點之一.

本實驗研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織中TGF-β1的mRNA的表達明顯高于空白對照組，阿奇霉素組和桔梗有效部位高、中、低劑量組降低了TGF -β1的mRNA的表達，其中阿奇霉素組和桔梗有效部位高劑量組降低TGF-β1的mRNA的表達最為顯著.說明桔梗有效部位抗MP的作用與TGF-β1有關(guān).其作用機制可能是通過下調(diào)TGF-β1的mRNA的表達，抑制EMT的過程，以達到修復(fù)肺泡上皮細胞的作用.

綜上所述，桔梗有效部位對大鼠MP感染致肺損傷的作用機制可能是通過下調(diào)TGF-β1的水平，從而抑制EMT的過程修復(fù)肺泡上皮細胞，改善肺損傷.對于TGF-β1作用機制有待于進一步深入研究.

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Effects of active parts isolated from Platycodon grandiflorum on expression of TGF-β1mRNA in rats infected with mycoplasma pneumoniae

DONG Kun1，SUIWen-xia1，YAO Lin2，SUIMei-jiao2，KOU Han-xu1，MA Ying-li1
（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，School of Pharmacy，Harbin 150040，China；2.Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences，Harbin 150036，China）

To investigate the effects of active parts isolated from Platycodon grandiflorum on the expression of TGF-β1 mRNA in rats infected with mycoplasma pneumonia.Themodel of rats infected with mycoplasma pneumoniae was established by nasal drip to observe the pathological changes extent of rats’lung tissue by lightmicroscope.The levels of TGF-β1 mRNA in pulmonary tissueswere determined with RT-PCR.Results showed that the control group rats’lung tissue structure were normal；model group rats’showed severe ormoderate inflammatory lesions，which predicted buildingmodel success；drug groups can reduce the lung inflammation and the lung tissue lesions were improved.TGF-β1 mRNA of the model group significantly increased than the coutrol group；medicated groups can reduce the expression of TGF-β1 mRNA，while the effect of positivemedicine group and the high dose group were better than others.The anti MP mechanism of Platycodon grandiflorum active partswas associated with downregulation of the expression of TGF-β1 mRNA and inhibiting the process of epithelial-mesenchymal transition.

Platycodon grandiflorum；mycoplasma pneumoniae；transforming growth factor -beta 1；RT-PCR

R285

A

1672-0946（2016）02-0142-04

2015-03-25.

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金項目（項目編號：2012RFQYS041）.

隋文霞（1988-），女，碩士，研究方向：中藥活性成分的機理研究.

馬英麗（1954-），博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥活性成分的機理研究.