許冉達(dá)，邵天宇，賈紹華

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150076）

秦皮乙素對荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響

許冉達(dá)，邵天宇，賈紹華

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150076）

研究秦皮乙素對S180荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響，探討秦皮乙素紅細(xì)胞免疫抗腫瘤機(jī)制.采用體內(nèi)移植S180腫瘤細(xì)胞株復(fù)制S180荷瘤小鼠模型.以紅細(xì)胞免疫花環(huán)實驗檢測紅細(xì)胞免疫黏附腫瘤細(xì)胞的能力；采用分光光度法測定荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜唾液酸含量、Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性.采用Western blot測定帶3蛋白含量.結(jié)果表明：秦皮乙素能夠增強(qiáng)S180荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫黏附腫瘤細(xì)胞的能力；增加紅細(xì)胞膜唾液酸含量及帶3蛋白含量；提高紅細(xì)胞膜Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性.秦皮乙素可能通過改善S180荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜的功能狀態(tài)，提高膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫黏附腫瘤細(xì)胞的能力，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用.

秦皮乙素；S180荷瘤小鼠；紅細(xì)胞免疫；抗腫瘤

秦皮為常用中藥，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，為木犀科植物苦櫪白蠟樹 （Fraxinus rhynchop hylla Hance）、白蠟樹（F.chinensis Roxb.）、尖葉白蠟樹（F.sz aboana Lingelsh.）或宿柱白蠟樹（F.stylosa Lingelsh.）等的干燥枝皮或干皮［1］.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，秦皮具有抗腫瘤作用、抗炎鎮(zhèn)痛作用、抗病原微生物作用、抗氧化作用以及神經(jīng)保護(hù)和血管保護(hù)等作用［2］.秦皮乙素（Aesculetin，AES）又稱七葉亭，是秦皮的主要有效成分，化學(xué)名稱為6，7-二羥基香豆素.已有文獻(xiàn)報道AES在體內(nèi)外均顯示抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，毒性較低，能夠免疫調(diào)節(jié)鼠類的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞［3］.紅細(xì)胞免疫是機(jī)體免疫不可或缺的一個組成部分，在研究中藥抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用中占有重要地位.因此，本研究初步探討了秦皮乙素與荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫功能的關(guān)系，為今后進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用機(jī)制提供幫助.

1　材料

1.1主要儀器

UV-2102紫外可見分光光度計（上海龍尼柯儀器有限公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），低溫高速離心機(jī)（AvantiTM68 centrifuge，Beckman），低速自動平衡離心機(jī)（LDZ5-2型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠），DYY-8C型電泳儀電源（北京市六一儀器廠），干式恒溫器（K30型，杭州奧盛儀器有限公司），超靈敏多功能成像儀（Amersham Imager 600型，GE Healthcare Bio-Sciernces AB）.

1.2試劑與動物

秦皮乙素（上海源葉生物科技有限公司，HPLC ≥98%，批號CMO317YA14）；黃芪多糖注射液（河南中亞沈鵬醫(yī)藥科技有限公司，批號160202711）；苯甲基磺酰氟（PMSF，上海源葉生物科技有限公司）；氯化鈉注射液（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號140111F1）；肝素鈉（Solarbio）；唾液酸測定試劑盒、ATP酶測定試劑盒以及考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；三甲基氨基甲烷（Tris，中國惠世生化試劑有限公司）；SPF級封閉群ICR小鼠，雌雄各半，體重（20±2）g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（吉-2011-0004）.

2　實驗方法

2.1實驗分組、給藥劑量及途徑

將S180瘤株腹水（乳白色透明狀態(tài)，血性腹水不可用）用無菌生理鹽水按1∶4比例稀釋，然后于ICR小鼠右腋下接種0.2 mL.小鼠隨機(jī)分組，分為正常對照組（不接種瘤株的正常鼠）、模型組、黃芪多糖組100 mg/kg、AES低劑量組20 mg/kg、中劑量組40 mg/kg和高劑量組80 mg/kg，每組10只.接種（除正常對照組外）第二天小鼠按0.2 mL/次進(jìn)行腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)7 d.

2.2紅細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞免疫黏附能力的測定

依照郭峰［4］建立的紅細(xì)胞黏附腫瘤紅細(xì)胞花環(huán)實驗，測定DTER.

2.3小鼠紅細(xì)胞膜影泡的制備

停藥24 h后，小鼠摘眼球采血，3 000 r/min離心5min，棄上清及中間白色絨毛狀膜成分，下層紅細(xì)胞沉淀用等滲磷酸緩沖液（PBS）洗滌3次，再懸浮于PBS（1∶1）中.取上述紅細(xì)胞懸液按1∶20加入預(yù)冷的10 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖溶液，同時加入蛋白酶抑制劑PMSF，4℃過夜后，4℃條件下13 500 r/min離心15 min，然后用10 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液洗滌1次，再用PBS洗滌2次，最后將白色沉淀物1∶1懸浮PBS中，即為紅細(xì)胞膜影泡（亦稱為不封閉懸液）.

2.4紅細(xì)胞膜唾液酸（Sialic acid，SA）濃度的測定

先用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒，應(yīng)用分光光度計測定紅細(xì)胞膜不封閉影泡影泡（制備方法同2.2）總蛋白OD值，根據(jù)公式計算出紅細(xì)胞膜影泡總蛋白的質(zhì)量濃度，再稀釋紅細(xì)胞膜影泡懸液到終質(zhì)量濃度0.1g/L.按照唾液酸濃度測定試劑盒要求，進(jìn)行唾液酸濃度的測定.

2.5紅細(xì)胞膜Na+，K+-ATP酶、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的測定

測定紅細(xì)胞膜不封閉影泡總蛋白質(zhì)量濃度，再稀釋到終質(zhì)量濃度0.1 g/L（方法同2.3）.按照試劑盒要求測定Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性.

2.6AES對帶3蛋白（Band3）的影響

采用Western blot測定Band3蛋白質(zhì)量濃度.配制5%濃縮膠、10%分離膠，80 V轉(zhuǎn)100 V電泳1.5 h，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，第二天回收一抗，TBST洗膜3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜后在成像儀中顯影.

2.7AES對紅細(xì)胞膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響

制備2%紅細(xì)胞懸液.按文獻(xiàn)［5］進(jìn)行紅細(xì)胞膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性的測定.

2.8數(shù)據(jù)處理

3　實驗結(jié)果

3.1AES對紅細(xì)胞黏附腫瘤細(xì)胞能力的影響

與正常組小鼠相比較，模型組紅細(xì)胞黏附腫瘤細(xì)胞的能力明顯下降（P＜0.01）.給予AES后荷瘤小鼠紅細(xì)胞黏附腫瘤細(xì)胞的能力有所恢復(fù)各劑量組與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）.結(jié)果見表1.

表1　AES對紅細(xì)胞黏附腫瘤細(xì)胞能力的影響（n=10，±S）

表1　AES對紅細(xì)胞黏附腫瘤細(xì)胞能力的影響（n=10，±S）

注：與正常組相比，△P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01.

25.65±2.67模型組　—　11.05±3.05△黃芪多糖組　100　20.40±4.22＊＊AES低劑量組　20　14.02±2.34 AES中劑量組　40　17.35±2.15＊＊AES高劑量組　80　19.08±3.01 DTER/%正常對照組　—組別　劑量/（mg·kg-1）＊＊

3.2AES對紅細(xì)胞膜SA濃度的影響

模型組荷瘤小鼠與正常組相比，紅細(xì)胞膜SA濃度有明顯的下降趨勢（P＜0.01）.給予不同濃度AES作用后，荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜SA濃度有所升高，與模型組相比，中劑量和高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)差異，見表2.

表2　AES對紅細(xì)胞膜SA濃度的影響（n=10，±S）

表2　AES對紅細(xì)胞膜SA濃度的影響（n=10，±S）

注：與正常組相比，△P＜0.01；與模型組相比，＊＊P＜0.01.

組別　劑量/（mg·kg-1）SA濃度/（mmol·L-1）0.104±0.028模型組　—　0.021±0.010△黃芪多糖組　100　0.078±0.046＊＊AES低劑量組　20　0.024±0.013 AES中劑量組　40　0.062±0.021＊＊AES高劑量組　80　0.072±0.029正常對照組　—＊＊

3.3AES對紅細(xì)胞膜Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的影響

結(jié)果見表3.模型組荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性較正常組明顯下降（P＜0.01）.給予不同濃度AES作用后兩種酶活性顯著上升，中高劑量組與模型組相比差異非常顯著（P＜0.01）.

表3　AES對紅細(xì)胞膜Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的影響（n=10，±S）

表3　AES對紅細(xì)胞膜Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的影響（n=10，±S）

注：與正常組相比，△P＜0.01；與模型組相比，＊＊P＜0.01.

組別　劑量/（mg·kg-1）Na+，K+-ATP酶活性/（μmolPi·mgprot-1·h-1）Ca2+，Mg2+-ATP酶活性/（μmolPi·mgprot-1·h-1）2.81±0.81　3.34±0.55模型組　—　1.03±0.52△　1.35±0.36△黃芪多糖組　100　2.59±1.38＊＊　3.03±0.60＊＊AES低劑量組　20　1.47±0.60　1.54±1.03 AES中劑量組　40　2.12±0.50＊＊　2.43±0.50＊＊AES高劑量組　80　2.29±0.55＊＊　2.57±1.00正常對照組　—＊＊

3.4AES對Band3蛋白表達(dá)和陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響的影響

如圖1所示，模型組荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜Band3蛋白的表達(dá)較正常組明顯減少，隨著給予AES濃度的增加，Band3蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢；而與正常組比較，模型組荷瘤小鼠的紅細(xì)胞膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低，給予AES治療后荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性均有所恢復(fù).與模型組相比，低劑量組有顯著提高（P＜0.05），中、高劑量組荷瘤小鼠有非常顯著提高（P＜0.04），結(jié)果見表4.常顯著提高（P＜0.01），AES中劑量組有顯著提高（P＜0.05），結(jié)果見表4.

圖1　紅細(xì)胞膜Band3蛋白western表達(dá)圖譜

表4　AES對紅細(xì)胞膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響（n=10，±S）

表4　AES對紅細(xì)胞膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響（n=10，±S）

注：與正常組相比，△P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05＊＊P＜0.01.

組別　劑量/（mg·kg-1）溶血細(xì)胞數(shù)達(dá)50%的時間t1/26.15±0.94模型組　—　9.23±0.78△黃芪多糖組　100　7.04±0.93＊＊AES低劑量組　20　8.19±1.36*AES中劑量組　40　7.57±0.79＊＊AES高劑量組　80　7.31±0.65 /min正常對照組　—＊＊

4　討論

AES作為秦皮的主要有效成分，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，已被證明具有抗菌［6］、抗氧化［7］、抗炎［8］、抗腫瘤［9］，保護(hù)神經(jīng)和血管［10］以及抑制5-脂氧合酶［11］等作用.抗腫瘤方面，AES對體內(nèi)外多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用和免疫調(diào)節(jié)作用，但針對荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響研究未見報道，故而對此進(jìn)行初步研究.

紅細(xì)胞免疫新興于20世紀(jì)末，是機(jī)體免疫系統(tǒng)不可分割的一部分，創(chuàng)造了免疫抗腫瘤的新途徑，而紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能以及存在于紅細(xì)胞膜上的相關(guān)物質(zhì)是實現(xiàn)其免疫功能的重要保障.紅細(xì)胞天然免疫黏附功能主要依賴于紅細(xì)胞膜上所含補(bǔ)體受體Ⅰ型（CR1），也被稱為C3b受體或CD35.腫瘤細(xì)胞可經(jīng)旁路途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，結(jié)合C3b（補(bǔ)體C3的裂解物），而紅細(xì)胞可以通過其膜上CR1與C3b結(jié)合從而識別和黏附腫瘤抗原，進(jìn)而達(dá)到清除免疫復(fù)合物的作用，因此CR1的數(shù)量與活性與紅細(xì)胞免疫抗腫瘤作用密切相關(guān).SA是紅細(xì)胞膜上CR1的重要構(gòu)成，其特殊結(jié)構(gòu)是細(xì)胞負(fù)電荷的主要來源，腫瘤患者的紅細(xì)胞膜表面SA濃度減少，會導(dǎo)致紅細(xì)胞的老化增加，細(xì)胞膜無法維持紅細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)，崩解破裂的紅細(xì)胞增多，最終影響紅細(xì)胞發(fā)揮其免疫作用，并且紅細(xì)胞數(shù)量的驟減可能是腫瘤與貧血經(jīng)常相伴而生的原因之一.從實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，與正常組相比較，模型組荷瘤小鼠的DTER與SA濃度顯著降低，而AES可明顯提高荷瘤小鼠DTER和SA濃度，說明AES可能通過提高SA濃度來恢復(fù)CR1的數(shù)量或活性，從而提高受到抑制的荷瘤小鼠的紅細(xì)胞天然免疫黏附能力.

Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶是紅細(xì)胞膜上重要的酶蛋白，膜內(nèi)外離子平衡、物質(zhì)交換、滲透壓等均依賴于ATP酶，也是衡量紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性及反映氧化應(yīng)激損傷程度的敏感指標(biāo)［12］.當(dāng)紅細(xì)胞膜ATP酶活性降低時，紅細(xì)胞的離子通透性改變，胞內(nèi)外電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)會發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞膜脆性增大、流變性降低［13］. Band3蛋白是骨架網(wǎng)絡(luò)在膜上的主要附著點(diǎn)，影響膜結(jié)構(gòu)和功能，其介導(dǎo)的HCO3-/Cl-跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)保障了紅細(xì)胞正常的載運(yùn)氣體功能，因此Band3蛋白又稱陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.在細(xì)胞中，Cl-是與Na+、K+、Ca2+等陽離子共同穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)離子環(huán)境的陰離子，等滲狀態(tài)下，Cl-通過Band3蛋白可以從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)，因此紅細(xì)胞溶血時間的長短能夠間接反映紅細(xì)胞陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性.Band3蛋白的表達(dá)多，即紅細(xì)胞陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性強(qiáng)，Cl-快速進(jìn)入胞內(nèi)于是縮短了紅細(xì)胞的溶血時間；反之亦然.本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組紅細(xì)胞膜上 ATP酶活性、Band3蛋白表達(dá)及陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性較正常組相比明顯降低，而AES能夠升高荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜上Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性，增加Band3蛋白的表達(dá)以及陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，即可能通過調(diào)節(jié)各種陰陽離子的跨膜，維持膜的穩(wěn)態(tài)，這可能是AES抗腫瘤的機(jī)制之一.

通過以上的研究發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞膜作為紅細(xì)胞的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，其上SA濃度保障了紅細(xì)胞天然免疫黏附能力，膜上Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶及Band3蛋白，可能通過對各種陰陽離子跨膜的調(diào)節(jié)，保障了紅細(xì)胞的穩(wěn)態(tài).而AES通過提高荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜上SA濃度以及Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶的活性，恢復(fù)荷瘤小鼠紅細(xì)胞Band3蛋白的表達(dá)和陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，提高紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，改善荷瘤小鼠紅細(xì)胞天然免疫黏附能力，從而增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫功能，達(dá)到抗腫瘤的作用.

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.255.

［2］汪國松，楊亞濱，丁中濤，等.秦皮的研究進(jìn)展［J］.國醫(yī)國藥：植物藥分冊，2017，22（3）：108-111.

［3］ LEUNG K N，LEUNG PY，KONG L P，et al.Immunomodulatory effects of esculetin（6，7-dihydroxycoumarin）on murine lymphocytes and peritonealmacrophages［J］.Cellular&Molecular Immunology，2005，2（3）：181.

［4］郭峰.現(xiàn)代紅細(xì)胞免疫學(xué)［M］.上海：第一軍醫(yī)人學(xué)出版社，2002：62，87.

［5］余果宇，田興亞，李家林.G6PD缺乏紅細(xì)胞膜Band3蛋白陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的改變［J］.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，24 （1）：5-7.

［6］DUNCAN SH，LEITCH E C，STANLEY K N，et al.Effects of esculin and esculetin on the survival of Escherichia coli O157 in human faecal slurries，continuous-flow simulationsof the rumen and colon and in calves［J］.British Journal Nutrition，2004，91 （5）：749-755.

［7］WANGC，PEIA，CHEN J，etal.A natural coumarin derivative esculetin offers neuroprotection on cerebral ischemia/reperfusion injury in mice［J］.Journal of Neurochemistry，2012，121（6）：1007-1013.

［8］方蓮花，呂揚(yáng)，杜冠華.秦皮的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2008，33（23）：2732-2736.

［9］ HU Y，CHEN X，DUAN H，et al.Chinese herbalmedicinal ingredients inhibit secretion of IL-6，IL-8，E-selectin and TXB2 in LPS-induced rat intestinal microvascular endothelial cells［J］.Immunopharmacology and Immunotoxicology，2009，31（4）：550-555.

［10］PARK S S，PARK S K，MOON S K，et al.Esculetin inhibits cell proliferation through the Ras/ERK1/2 pathway in human colon cancer cells［J］.Oncology Reports，2011，25（1）：223 -230.

［11］KWON O S，CHOI JS，KIM H P，et al.Inhibition of 5-lipoxygenase and skin inflammation by the aerial parts of Artemisia capillaris and its constituents［J］.Archives of Pharmacal Research，2011，34（9）：1561-1569.

［12］高維緯，史冀鵬.不同劑量牛磺酸對拳擊運(yùn)動員紅細(xì)胞ATP酶活性的影響［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報，2011，34（3）：49-51，63.

［13］周游，譚穎，張文群，等.小檗堿對糖尿病大鼠腦內(nèi)與血中Aβ的影響［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015，31（4）：385-388.，392.

Effect of Aesculetin on function of erythrocytemembrane in tumor-bearing m ice

XU Ran-da，SHAO Tian-yu，JIA Shao-hua
（School of Pharmacy，Harbin University of Commerce，Harbin 150076）

To study the effect of Aesculetin on the function of erythrocytemembrane in S180tumor-bearingmice and its erythrocyte immune mechanism of antitumor the model of S180tumor-bearingmice was obtained by transplanting S180tumor cell line in vivo.Erythrocytic immunity was assayed by red blood cell immune complexes rosette.The tumor-bearingmice red cellmembrane sialic acid content，activities of Na+，K+-ATPase and Ca2+，Mg2+-ATPase were tested by spectrophotometric method.Western Blot was used to determine the content of Band3 protein.Results indicate that Aesculetin can enhance the ability of S180tumor-bearingmice red cell immune adhesion of tumor cells，increase the content of saliva acid and Band3 protein in erythrocyte membrane and improve the activities of Na+，K+-ATPase and Ca2+，Mg2+-ATPase.Aesculetin may improve the function of erythrocyte membrane in S180tumor bearingmice，improve the stability of themembrane and enhance the ability of erythrocyte immune adherence to tumor cells，so as to fulfill its antitumor effect.

Aesculetin；S180tumor-bearingmice；erythrocyte immune；antitumor

R285

A

1672-0946（2016）02-0146-04

2015-12-02.

哈爾濱商業(yè)大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目（YJSCX2014-336HSD）；哈爾濱商業(yè)大學(xué)博士科研啟動項目（14LG01）

許冉達(dá)（1991-），男，碩士，研究方向：抗腫瘤藥物活性及其機(jī)制.

賈紹華（1969-），男，博士，教授，研究方向：抗腫瘤藥物活性及其機(jī)制.