王　銳，曹　贏，王知斌

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

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“一測多評”法測定茜草中3種有效成分百分含量

王銳，曹贏，王知斌

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

采用“一測多評”法測定茜草中3種成分的百分含量.流動相為乙腈-0.2%磷酸水(43∶57)流速1.0 mL/min，檢測波長為250 nm.以大葉茜草素為內(nèi)標(biāo)物，測定與茜草素、羥基茜草素的相對較正因子.計算茜草中3種成分的含量，并比較“一測多評”法的計算值與外標(biāo)法實測值的相似度. “一測多評”法和外標(biāo)法測得的茜草素、羥基茜草素的含量相似度均為0.99，“一測多評”法和外標(biāo)法的實測值間無顯著性差異.建立的“一測多評”法適用于茜草中3種有效成分的含量測定，相對校正因子可信.

“一測多評”法；茜草；大葉茜草素；羥基茜草素；茜草素

茜草為茜草科植物(Rubia cordifolia L.)的干燥根及根莖，其具有涼血、止血、化瘀、通經(jīng)的功效，主治吐血、衄血、外傷出血、跌打腫痛、風(fēng)濕痹痛、經(jīng)閉瘀阻等癥[1].茜草中主要含有蒽醌、萘醌及其苷類、環(huán)己肽類、萜類等[2].茜草成分復(fù)雜、多樣并且作用機制模糊，因此應(yīng)進(jìn)行多成分的百分含量測定用于茜草藥材的質(zhì)量控制.由于中藥化學(xué)對照品分離難度大或供應(yīng)價格高等元素，限制了多指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制的外標(biāo)法的實際應(yīng)用.“一測多評”法是通過測定中藥中一種代表性成分的百分含量，依據(jù)相對較正因子推算該中藥中多種待測成分的百分含量，并控制計算值與實測值符合定量方法學(xué)要求的一種多指標(biāo)同步質(zhì)量控制方法[3-4].本研究采用“一測多評”法，以大葉茜草素為內(nèi)標(biāo)物，測定10批茜草藥材中茜草素、羥基茜草素2種成分的百分含量，并與外標(biāo)法實測值進(jìn)行比較，為茜草的百分含量測定提供一種可供選擇的新方法，為茜草的研究提供數(shù)據(jù)支持.

1　材 料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，包括1260系列四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器、化學(xué)工作站；Milli-Q超純水系統(tǒng)(法國Millipore公司)；FA2004分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFT-200告訴中藥粉碎機(浙江溫嶺市大德中藥機械有限公司).

茜草，共10批，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)閆廣利副教授鑒定為茜草科植物(Rubia cordifolia L.)，購于市售藥店；大葉茜草素、羥基茜草素及茜草素均為成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供；甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水，自制；鹽酸、三乙胺均為分析純.

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件及適用性

Waters WAT054270-C8柱(250mm×4.6mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.2%磷酸水(43∶57)流速1.0 mL/min；檢測波長為250 nm，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL.在上述色譜條件下，各組分分離度良好，峰形尖銳，基線平穩(wěn)，供試品色譜與對照品色譜在相同時間上有對應(yīng)的吸收峰.色譜圖見圖1.

2.2對照品溶液的制備

精密稱取大葉茜草素對照品10.31 mg，置于100 mL容量瓶內(nèi)，加甲醇溶解至刻度，超聲處理，制成每1 mL含大葉茜草素0.1 mg的大葉茜草素對照品溶液.精密稱取羥基茜草素對照品10.02 mg，置于100 mL容量瓶內(nèi)，加甲醇溶解至刻度，超聲處理，再用移液管移取4 mL溶液于10 mL容量瓶中，超聲處理，制成每1 mL含羥基茜草素40 μg的羥基茜草素對照品溶液.按照上述方法，制成每1 mL含茜草素40 μg的茜草素對照品溶液.用前以0.45 μm微孔濾膜過濾.

1-茜草素 2-羥基茜草素 3-大葉茜草素圖1　對照品溶液(A)、樣品溶液(B)HPLC色譜圖

2.3供試品溶液的制備

使用小型粉碎機將茜草飲片粉碎成細(xì)粉過二號篩，精密稱取茜草藥品約0.5 g，置于錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，放置過夜，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖均，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，蒸干，殘渣加甲醇-25%鹽酸(4∶1)混合溶液20 mL溶解，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，加入三乙胺3 mL，混均，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖均，濾過，取續(xù)濾液，即得.用前以0.45 μm微孔濾膜過濾.

2.4精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測得大葉茜草素峰面積RSD(n=6)為0.62%；羥基茜草素峰面積RSD(n=6)為0.63%；茜草素峰面積RSD(n=6)為0.58%，表明儀器精密度良好.

2.5重復(fù)性試驗

取同一份茜草藥材0.5 g，共5份，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下測定測得大葉茜草素峰面積RSD(n=5)為1.35%；羥基茜草素峰面積RSD(n=5)為1.03%；茜草素峰面積RSD(n=5)為1.31%，表明該方法重復(fù)性良好.

2.6穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液10 μL，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進(jìn)樣，測得大葉茜草素峰面積RSD(n=9)為1.25%；羥基茜草素峰面積RSD(n=9)為0.67%；茜草素峰面積RSD(n=9)為1.45%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.7加樣回收率試驗

取同一份已知百分含量的茜草樣品0.5g共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶內(nèi)，每份精密加入含大葉茜草素、羥基茜草素、茜草素對照品溶液1 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，計算平均回收率分別為99.38% (RSD=1.94)、98.14% (RSD=1.29)、95.91% (RSD=1.57)，表明該方法準(zhǔn)確度良好，符合規(guī)定.

2.8校正因子的計算

取2.2項下不同體積的對照品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10 uL，測定各成分峰面積.以大葉茜草素為內(nèi)標(biāo)物，按公式fk/m =fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak) ，其中Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量，Am為其他組分的峰面積，Wm為其他組分的質(zhì)量或濃度.分別計算羥基茜草素、茜草素的校正因子，結(jié)果見表1.

表1　不同體積對照品溶液對相對校正因子的影響

2.9相對校正因子的重現(xiàn)性

取2.2項下對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，考察兩種高效液相色譜儀Agilent、Waters和兩種色譜柱DiKMA、Waters測得的相對校正因子，見表2.

表2　不同儀器和色譜柱對相對校正因子的影響

2.10色譜峰專屬性

一測多評在應(yīng)用于定量測量時，由于只用到了一個對照品，其他待測成分無對照品，無法準(zhǔn)確確定待測組分峰的位置，因此，對成分峰進(jìn)行定位是一測多評法要解決的關(guān)鍵問題之一[5].本研究分別采用各待測成分間的保留時間差、相對保留值2種參數(shù)作為定位標(biāo)準(zhǔn)，在兩種高效液相色譜儀Agilent、Waters和兩種色譜柱Agilent、Waters下進(jìn)行考察.結(jié)果表明，不同儀器和色譜柱下個成分間保留時間差波動較大，相對保留值波動較小，因此選用相對保留值作為上述目標(biāo)色譜峰的定位指標(biāo)比較合適.以相對保留值結(jié)合各色譜峰的紫外吸收特征能夠判斷目標(biāo)峰的峰位置.相對保留值見表3.

表3　茜草中各組分的相對保留值

2.11一測多評法與外標(biāo)法結(jié)果比較

取10批茜草藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相百分含量測定.采用外標(biāo)法和一測多評法計算茜草藥材中大葉茜草素、茜草素、羥基茜草素百分含量，結(jié)果見表4.外標(biāo)法實測值與一測多評計算百分含量值經(jīng)t檢驗比較，無顯著性差異.由此說明一測多評法可用于茜草藥材的多成分百分含量測定.

表4　茜草中各有效成分的“一測多評”法與外標(biāo)法結(jié)果比較

3　討　論

茜草中大葉茜草素為萘醌類有效成分，羥基茜草素和茜草素為蒽醌類有效成分，天然蒽醌類化合物有抗菌消炎、抗腫瘤、對心腦血管作用、對中樞系統(tǒng)作用，同時蒽醌類化合物對動物或人體的正常細(xì)胞存在一定的對性作用[6-8].為了更好地利用茜草這一藥材，就不得不考慮其進(jìn)行更深一步的研究.目前中藥化學(xué)對照品價格昂貴并且難以制得，種類和數(shù)量還不能滿足質(zhì)量檢測和新藥研發(fā)的需求.大葉茜草素為茜草中主要有效成分，對照品較容易得到，因此被選為內(nèi)標(biāo)物，利用“一測多評”法測得茜草中其余2種有效成分，建立了大葉茜草素與其余2種有效成分的相對校正因子.一測多評法實現(xiàn)了在對照品缺乏的情況下，進(jìn)行中藥多成分定量和多指標(biāo)質(zhì)量控制，顯著降低了成本，提高了效率.

[1]CHEN S B, FENG R Z, CHEN B Z,etal. A study on the medicinal plants of genus Rubia.I.Botanical Origins and Resource of Chinese traditional drug “Qian Cao” (Madder)[J], Natural Product Research and Development, 1991,3(4): 8-15.

[2]王曉建,黃勝陽. 茜草屬植物化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2012, 19(2): 109-112.

[3]王智民, 高慧敏, 付雪濤, 等. “一測多評”法中藥質(zhì)量評價模式方法學(xué)研究[J]. 中國中藥雜志, 2006, 31(23): 1925-1928.

[4]沈小鐘, 劉瑤, 楊燕軍, 等. 一測多評法研究進(jìn)展[J]. 中國藥業(yè), 2013, 22(13): 1-5.

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Determination of three active ingredients in Radix Rubiae by quantitative analysis of multi-components with single-marker

WANG Rui, CAO Ying, WANG Zhi-bin

(Heilongjiang University of Chinese Traditional Medicine, Harbin 150040, China)

To establish quantitative analysis of multi-components with a single-marker (QAMS) for determining contents of three active ingredients from Radix Rubiae. Contents of three active ingredients in Radix Rubiae were determined by HPLC. It was used with acetonitrile-0.2%phosphoric acid solution (43∶57) as the mobile phase, the flow rate was 1.0 mL/min, the detection wavelength was set at 250 nm. With Rubimaillin as a internal standard, relative correlation factors (RCF) of Purpurin, Alizarin to Rubimaillin were calculated, contents of these three ingredients were determined by the external standard method and QAMS, respectively. Results indicated that these two methods did not show significant difference in assay results of contents of these three ingredients with similarity of 0.99. QAMS could be used for quality control of Radix Rubiae.

quantitative analysis of multi-components with a single-marker; Radix Rubiae; rubimaillin; purpurin; alizarin

2016-01-16.

黑龍江省自然科學(xué)基金(H201472)

王銳(1977-)，男，碩士，副教授，研究方向：新藥研發(fā)及新劑型研究.

王知斌(1976-)，男，博士，副教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.

R284

A

1672-0946(2016)04-0426-03