李陳雪，曹　贏，曲炳楠，楊　婧

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

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四種提取方法提取黑雞樅菌多糖的對(duì)比分析研究

李陳雪，曹贏，曲炳楠，楊婧

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

采用四種方法提取黑雞樅菌中的多糖，從而優(yōu)選出最佳方法.通過對(duì)未粉碎、普通粉碎、超微粉碎、超微粉碎聯(lián)合超聲法四種不同提取工藝進(jìn)行對(duì)比研究，確定超微粉碎聯(lián)合超聲法對(duì)黑雞樅菌多糖的提取率具有顯著地提高作用.結(jié)果表明,超微粉碎得到200目黑雞樅菌超微粉末，超聲提取2 h，提取功率600 W，提取物進(jìn)一步純化得到提取率為14.43%的精制黑雞樅菌多糖.超微粉碎聯(lián)合超聲法是提取黑雞樅菌中多糖的理想方法.

雞樅菌多糖；超微粉碎；超聲提取

雞樅菌(Termitomyces albuminosus)，又叫雞絲菇、白蟻菇、三壇菌.隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，口蘑科(Tricholomataceae)是一類美味的野生菌[1-2].其中，黑雞樅有養(yǎng)血、潤(rùn)燥、健脾胃等功效.本文采用四種不同的提取方法對(duì)黑雞樅菌的多糖的提取展開研究.為提高黑雞樅菌多糖的提取率，將傳統(tǒng)的水提醇沉法進(jìn)行改進(jìn)，采用先進(jìn)的超微粉碎聯(lián)合超聲波輔助提取黑雞樅菌中的多糖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超微粉碎聯(lián)合超聲法是提取黑雞樅菌中多糖的理想方法.

1　實(shí)驗(yàn)儀器與材料

黑雞樅菌(購(gòu)自云南省昆明市，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中化教研室鑒定合格)；葡萄糖、硫酸、苯酚等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；UV-2000 型紫外可見分光光度儀(尤尼科儀器上海有限公司)；電子調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；離心沉淀機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)；冷凍干燥機(jī)(VirTis Benchtop 2K)；其它試劑均為分析純.

2　黑雞樅菌多糖的含量測(cè)定方法的建立

2.1供試品溶液的制備

取黑雞樅菌提取物10 mg，置于50 mL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度，以3 000 r/min離心20 min，取上清液.精密移取提取液2 mL，定容至10 mL，混勻即得.

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取10 mg于105 ℃烘箱中干燥恒重的無水葡萄糖，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液.

2.3最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 mL，分別置于20 mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，加入濃硫酸5 mL，迅速混勻，置沸水浴，20 min后取出置于冷水浴5min.以相應(yīng)試劑為空白，在分光光度儀上進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描.

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL溶液加入具塞試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1 mL，加入5 mL濃硫酸和1 mL的5%苯酚溶液，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫.用同樣方法處理的蒸餾水作為空白溶液，在210 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y= 0.009x- 0.028，R2= 0.999 3，線性范圍為20～80 μg/mL.

2.5黑雞樅菌多糖提取率的計(jì)算

提取物中黑雞樅菌多糖含量=[(黑雞樅菌多糖計(jì)算量/提取物稱取量)×100%]×提取物總量；

提取率(%)=(提取物黑雞樅菌多糖含量/黑雞樅菌量)×100%.

2.6水提醇沉法提取黑雞樅菌多糖工藝

取一定量黑雞樅菌，加熱回流提取1 h，過濾去除上清液后濃縮，濃縮液加入5倍體積的95%乙醇，冰箱冷藏靜置24 h后過濾[3].經(jīng)無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌沉淀，采用冷凍干燥法，在箱體壓力抽至30～60 Pa，凍干制品-30 ℃左右的條件下，歷時(shí)48 h凍干得到黑雞樅菌粗多糖.將所得粗多糖配制成2 mg/mL的水溶液，加入其1/5體積的氯仿—正丁醇(4∶1)混合溶液，充分震蕩30 min，經(jīng)離心去除沉淀.再取上清液，向其中加入1/5體積的氯仿-正丁醇混合溶液，重復(fù)2～3次，直至無明顯沉淀產(chǎn)生，即采用Sevag法獲得精制的黑雞樅菌多糖.

2.7不同粉碎工藝對(duì)黑雞樅菌多糖提取的影響

以黑雞樅菌多糖的提取率為指標(biāo)，下面分別對(duì)未粉碎、普通粉碎、超微粉碎、超微粉碎聯(lián)合超聲法四種不同提取工藝進(jìn)行對(duì)比，考察不同粉碎度對(duì)多糖提取的影響.

未粉碎黑雞樅菌提取工藝 將干黑雞樅菌原藥材50 g，直接按2.3項(xiàng)下提取，計(jì)算黑雞樅菌多糖提取率.

普通粉碎提取工藝 將冷凍干燥法脫水干燥的黑雞樅菌原藥材放入微型粉碎機(jī)中粉碎5 min，過40目篩后，取50 g粉碎物按2.3項(xiàng)下提取，計(jì)算黑雞樅菌多糖提取率.

超微粉碎提取工藝 將采用冷凍干燥法脫水干燥的黑雞樅菌原藥材放入振動(dòng)式超微粉碎機(jī)中粉碎20 min，過200目篩，取50 g微粉，按2.3項(xiàng)下工藝制備黑雞樅菌多糖，計(jì)算黑雞樅菌多糖的提取率.

2.8超微粉碎聯(lián)合超聲法提取黑雞樅菌多糖工藝

將采用冷凍干燥法脫水干燥的黑雞樅菌原藥材，放入振動(dòng)式超微粉碎機(jī)中粉碎20 min，篩分出200目微粉50 g，將雞樅菌粉碎物加入含20倍蒸餾水的圓底燒瓶中，超聲2 h后過濾去除上清液，再加入30倍蒸餾水在90～100 ℃加熱回流8 h，收集提取液.提取物經(jīng)粗濾后，將濾液放置離心沉淀機(jī)中，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速將浸提液離心10 min，取上清液，加熱濃縮至200 mL，加入3倍體積的95%乙醇，經(jīng)離心取多糖沉淀，再用無水乙醇進(jìn)一步脫水，所得沉淀物溶于適量水中[4].將溶液放入冰箱預(yù)凍48 h，放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h，得到黑雞樅菌多糖提取物凍干制品.進(jìn)而采用Sevag法除去雜質(zhì)，獲得精制多糖[4].

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1黑雞樅菌多糖的檢測(cè)

3.1.1苯酚硫酸法

采用苯酚硫酸法檢測(cè)，可見含有多糖溶液的試管呈紅棕色，而不含多糖的試管中無明顯顏色變化.

3.1.2紫外分光光度法測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定得到吸收譜圖在200 nm處可見明顯吸收峰.(見圖1)

圖1　UV-可見全波長(zhǎng)掃描圖譜

3.2提取工藝的確定

分別采用超微粉碎聯(lián)合超聲、超微粉碎、普通粉碎及未粉碎黑雞樅菌四種提取工藝，以黑雞樅菌多糖的提取率為指標(biāo)，考察不同提取工藝對(duì)黑雞樅菌多糖提取的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1 .

表1　四種提取工藝對(duì)提取率的影響對(duì)比

由表1可知三種粉碎粒度中，普通粉碎比未粉碎黑雞樅菌工藝的提取率有并不明顯的提高，而超微粉碎提取工藝比二者的提取工藝提高較多，而以超微粉碎聯(lián)合超聲提取法開展黑雞樅菌的提取更有利于黑雞樅菌中多糖的提取.

4　結(jié)　語

通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，超微粉碎對(duì)于提取率的提高有較明顯的提升作用.探究其原因，可能是因?yàn)槌⒎鬯槠茐闹参锏募?xì)胞壁能更為徹底，更有利于多糖的提取.

實(shí)驗(yàn)中黑雞樅菌多糖最終的平均提取率穩(wěn)定在14%以上.對(duì)黑雞樅菌多糖的提取乃至此類菌類的多糖提取均有較大的借鑒意義.

[1]KIRK P M, CANNON P F, DAVID J C,etal. Ainsworth & Bisby ’ sdictionary of the fungi[M]. Wallingford, UK: CAB1 Publishing, 2001.

[2]KANSCI G, MOSSEBO D C, SELATSA A B,etal. Nutrient content of some mushroom species of the genus Termitomyces consumed in Cameroon[J]. Food / Nahrung, 2003, 47(3): 213-216.

[3]譚曉虹, 方秀梅. 云南產(chǎn)雞樅菌多糖含量測(cè)定[J].張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 21(1): 2-3.

[4]楊婧, 張帥, 王冬梅, 等. 超微粉碎聯(lián)合超聲法提取紅花中多糖工藝研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2014, 30(3): 354-356.

Comparative study on extraction of polysaccharides from Termitomyces albuminosus by different preparation technology

LI Chen-xue, CAO Ying, QU Bing-nan, YANG Jing

(Heilongjiang University of Chinese Traditional Medicine, Harbin 150040,China)

Black Termitomyces albuminosus polysaccharide was extracted by the best method of four methods. Four different extraction processes were compared including not crushed,ordinary grinding, ultrafine grinding,superfine grinding method combined with ultrasound. The ultramicro pulverization method combined with ultrasound could significantly improve the effect on black Termitomyces albuminosus polysaccharide extraction rate. Results indicated that Ultramicro smashing could get 200 mesh black Termitomyces albuminosus ultrafine powder,ultrasonic extraction 2 h,extraction power 600 W.The extraction was further purified extraction rate of polysaccharides to14.43% of refined black Termitomyces. Ultrafine grinding method combined with ultrasound is an ideal method for extract polysaccharide from black Termitomyces albuminosus.

Black Termitomyces albuminosus; ultrafine grinding; ultrasonic extraction

2015-09-21.

國(guó)家自然科學(xué)基金(81473359)

李陳雪(1991-)，女，碩士，研究方向：中藥新藥與新劑型研究.

楊婧(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：中草藥防治腫瘤.

TQ461

A

1672-0946(2016)04-0403-03