夏鵬，黃晶

·綜述·

胞外囊泡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究進(jìn)展

夏鵬，黃晶

胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是釋放到細(xì)胞外的膜性小囊泡，是傳遞細(xì)胞間信號(hào)的一種新方式，在生理或病理情況下發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。幾乎所有類型的細(xì)胞均可以產(chǎn)生并釋放 EVs，尤其是腫瘤細(xì)胞［1-2］。越來越多的證據(jù)表明，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，腫瘤來源的胞外囊泡能夠通過傳遞囊泡中的內(nèi)容物來改變受體細(xì)胞的生物學(xué)功能，比如導(dǎo)致免疫抑制，誘導(dǎo)血管生成，甚至促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［3-4］。近年來，關(guān)于胞外囊泡與腫瘤關(guān)系的研究越來越受到人們的關(guān)注。

1　胞外囊泡的概述

Chargaff 和 West［5］在 1946 年發(fā)現(xiàn)胞外囊泡作為促凝血的血小板微顆粒存在于健康人的血漿中。之后，又發(fā)現(xiàn)直腸癌微絨毛細(xì)胞可以釋放質(zhì)膜囊泡［6］。直到 1987 年，Johnstone 等［7］觀察到綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞在成熟過程中會(huì)釋放一種囊泡狀結(jié)構(gòu)的小體，并命名為外泌體。隨后發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞均可產(chǎn)生外泌體，如樹突狀細(xì)胞、血小板、神經(jīng)元、小腸上皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多種類的胞外囊泡被發(fā)現(xiàn)。在靜息狀態(tài)和（或）活化狀態(tài)下，幾乎所有類型的細(xì)胞都能組成性地和（或）誘導(dǎo)性地產(chǎn)生并釋放 EVs，包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。而且 EVs已被發(fā)現(xiàn)存在于多種體液中，包括血液、尿液、唾液、乳汁等［8］。根據(jù)細(xì)胞或組織來源的不同，EVs 可被分為若干種，如前列腺來源的 EVs 稱為前列腺小體，腫瘤來源的 EVs稱為腫瘤小體。根據(jù)產(chǎn)生機(jī)制的不同，EVs 可被分為以下三大類：外泌體、微囊泡和凋亡小體（圖 1）。

外泌體是由多囊泡小體和細(xì)胞質(zhì)膜融合后被細(xì)胞釋放出來的囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為 40 ～ 100 nm；微囊泡是由細(xì)胞質(zhì)膜脫落或出芽后被細(xì)胞釋放出來的囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為100 ～ 1000 nm；凋亡小體是由程序性死亡的細(xì)胞通過出泡的方式產(chǎn)生的，內(nèi)含有高度致密的細(xì)胞核碎片的囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為 500 ～ 2000 nm（圖 1）。新近報(bào)道，某些腫瘤細(xì)胞能釋放直徑非常大的胞外囊泡（1 ～ 10 μm），稱之為巨型腫瘤小體；這是一群比普通 EVs 大十倍以上的新型胞外囊泡，其顯著特點(diǎn)就是產(chǎn)生這種 EVs 的母體細(xì)胞被證明是具有高度轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞［9］。盡管 EVs 有多種分類，但是迄今為止人們還未對(duì)其具體而精確的分類標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成共識(shí)，并且目前仍無法篩選出能區(qū)分出這幾種 EVs 亞群的分子標(biāo)志物［10］。

EVs 主要由外層的脂質(zhì)雙分子層和包繞其中的內(nèi)容物組成。EVs 具有脂質(zhì)雙分子層包裹的囊泡狀結(jié)構(gòu)，這猶如在大海中航行的貨船，它能攜帶諸多“貨物”，包括蛋白（如細(xì)胞因子、膜受體蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、熱休克蛋白等），核酸（如 DNA、mRNA、小干擾 RNA、長非編碼 RNA 等）和脂類［11］。依據(jù)蛋白組成的特異性，可對(duì)分離純化的 EVs進(jìn)行鑒定。近期 EVs 中的核酸成分也受到研究者們的高度重視，其中 EVs 中的 mRNA 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后能被直接翻譯成蛋白質(zhì)，microRNA（miRNA）可定向調(diào)節(jié) mRNA 的功能，shuttle RNA 可影響受體細(xì)胞蛋白質(zhì)的產(chǎn)生［12］。

早在 30 年前，研究者們就發(fā)現(xiàn) EVs 能夠被受體細(xì)胞攝入胞內(nèi)，并引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)。目前，EVs 已被當(dāng)作一個(gè)功能強(qiáng)大的細(xì)胞間通訊的媒介，攜帶和傳遞重要的信號(hào)分子，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)并與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，腫瘤患者外周血或者其他體液中含有更高水平的循環(huán)形式的 EVs［13］。這些來自于腫瘤患者或者荷瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的 EVs 中含有大量的腫瘤相關(guān)的標(biāo)志分子，如糖類抗原 19-9（CA 19-9）、小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白 2（TYRP 2）、Melan-A、突變基因 K-Ras 以及活化形式的表皮生長因子受體（EGFR）［14-15］。更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，腫瘤來源的 EVs 能夠通過旁分泌或者內(nèi)分泌的形式與近處或遠(yuǎn)處正常組織細(xì)胞發(fā)生“相互對(duì)話”，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［16］。

圖1　胞外囊泡的主要分類及其特點(diǎn)

2　胞外囊泡與腫瘤發(fā)生

最初從腫瘤細(xì)胞分泌獲得的外泌體，因其包含有腫瘤抗原，可以通過 APC 交叉呈遞給細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生腫瘤殺傷作用，因此最初研究圍繞外泌體的免疫刺激作用，探討其作為潛在有效的腫瘤疫苗。然而，研究者們又發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正常細(xì)胞出現(xiàn)基因突變時(shí)，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可通過膜融合將突變信息傳遞給其他正常細(xì)胞，導(dǎo)致原癌基因激活、抗凋亡基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。Melo 等［17］報(bào)道，乳腺癌來源的外泌體包含的 miRNA 能在 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體協(xié)助下，不依賴細(xì)胞，在體外即能將前體 miRNA轉(zhuǎn)變成促腫瘤的成熟形式的 miRNA。正是由于腫瘤來源的外泌體包含了幫助完成這一轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵分子 Dicer、argonaut protein 2（Ago 2）和 TAR RNA-binding protein （TRBP），使得正常的上皮細(xì)胞被重編程改變整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，從而表達(dá)腫瘤相關(guān)蛋白進(jìn)而惡變成腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。同樣在另一個(gè)研究中，Boelens 等［18］發(fā)現(xiàn)將基質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞能刺激模式識(shí)別受體 RIG-I 并激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 1（signal transducer and activator of transcription-1，STAT-1）依賴的抗病毒信號(hào)通路以及 Notch 信號(hào)通路，從而會(huì)增加乳腺癌患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的耐受性，并且揭示外泌體中引發(fā)此放療耐受效應(yīng)的物質(zhì)本質(zhì)就是存在于外泌體中的 RNA 成分。類似的，Skog 等［19］近期研究結(jié)果也提示神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生的含有 mRNA 及 miRNA 的外泌體在被大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞攝入后促進(jìn)腫瘤鄰近微血管發(fā)生小血管化，有利于腫瘤的進(jìn)一步生長和轉(zhuǎn)移。這就提示腫瘤來源的 EVs 能夠利用其包含的 miRNA 或 RNA 使得受體細(xì)胞發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化或者促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

Antonyak 等［20］證實(shí)利用兩株人腫瘤細(xì)胞系（MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞系和 U87 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系）產(chǎn)生的微囊泡能促使正常的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞。而完成這一轉(zhuǎn)變需要腫瘤來源的微囊泡中兩個(gè)關(guān)鍵蛋白分子：組織型谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和纖維黏連蛋白，腫瘤來源的微囊泡中這兩個(gè)分子會(huì)共同激活受體細(xì)胞的絲裂原信號(hào)通路，使正常細(xì)胞獲得類似腫瘤細(xì)胞的特征（如錨定-非依賴生長和極強(qiáng)的細(xì)胞生存能力）。同時(shí)，Al-Nedawi等［21］的研究也表明，早期神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者只有少數(shù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)致瘤性的表皮細(xì)胞生長因子受體 vIII（EGFRvIII），然而進(jìn)入進(jìn)展期后大部分的膠質(zhì)瘤細(xì)胞卻獲得被轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞表型，其機(jī)制是由于荷載有 EGFRvIII 蛋白的 EVs從這些少數(shù)細(xì)胞分泌后會(huì)被其余大多數(shù)正常細(xì)胞共享，導(dǎo)致受體細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）和 Akt 信號(hào)通路的激活以及 EGFRvIII 調(diào)節(jié)基因（如 VEGF、Bcl-xL 和 p27）表達(dá)發(fā)生改變，引發(fā)受體細(xì)胞錨定非依賴生長能力增強(qiáng)，即發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化。這就提示腫瘤來源的 EVs 能夠利用其包含的蛋白分子使得受體細(xì)胞發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

此外，Bergsmedh 等［22］研究也發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的凋亡小體能夠?qū)z入該凋亡小體的正常成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成失去接觸抑制的腫瘤細(xì)胞。研究者利用熒光原位雜交分析發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的凋亡小體的 DNA 在被吞噬到宿主細(xì)胞后被選擇性擴(kuò)增，進(jìn)而使得整個(gè)體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞群都被轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞，并且這些宿主細(xì)胞都是 p53 陰性的成纖維細(xì)胞，提示腫瘤來源的 EVs 能夠利用其包含的 DNA 成分使得受體細(xì)胞發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

3　胞外囊泡與腫瘤發(fā)展

腫瘤細(xì)胞來源的 EVs 可以同時(shí)進(jìn)入淋巴系統(tǒng)和腫瘤組織中，通過釋放細(xì)胞因子、與腫瘤抑制因子相互作用等方式，改變腫瘤微環(huán)境，作為信息載體參與腫瘤的發(fā)展過程。

3.1胞外囊泡與腫瘤增殖

腫瘤來源的 EVs 既可引起抗腫瘤免疫應(yīng)答，又可在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)免疫耐受，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，其作用機(jī)制與 EVs 含有的腫瘤相關(guān)抗原和免疫抑制分子相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)：人乳腺癌和胸膜間皮瘤細(xì)胞系的外泌體含有 NKG2D 配體，能夠抑制 NK 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)腫瘤生長；腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可誘導(dǎo)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為髓源性抑制細(xì)胞，阻止其向樹突狀細(xì)胞分化；膠質(zhì)瘤來源的 EVs 可直接抑制 CD3ζ的表達(dá)，從而抑制 CD8+T 細(xì)胞的功能；黑色素瘤來源的包含 TNF-α 的外泌體可直接誘導(dǎo) T 細(xì)胞凋亡［23］。此外，有研究顯示，膠質(zhì)細(xì)胞瘤來源的微顆?？梢源龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；同樣，肝癌細(xì)胞來源的 EVs 可以將一種 lncRNA 轉(zhuǎn)移給其他肝癌細(xì)胞促進(jìn)其增殖［24］；Yang 等［25］也證實(shí)膀胱癌來源的 EVs 能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其增殖。總之，EVs 與腫瘤細(xì)胞增殖關(guān)系密切，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

3.2胞外囊泡與腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成

EVs 與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、腫瘤侵襲和浸潤，以及腫瘤血管生成等諸多過程。證實(shí)腫瘤來源的 EVs 能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成的研究者歸功于 Jung 等［26］。然而 Hoshino 等［27］的一項(xiàng)重磅研究發(fā)現(xiàn)，準(zhǔn)備并形成腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的傀儡是攝入了腫瘤來源 EVs的器官常駐細(xì)胞，并且具有特定器官轉(zhuǎn)移傾向性的腫瘤細(xì)胞之所以能特異性地轉(zhuǎn)移到靶器官中，正是由于腫瘤來源的EVs 膜表面的整合素分子起到了關(guān)鍵性作用。腫瘤來源的EVs 膜表面的整合素分子類型與轉(zhuǎn)移灶部位有類似于配體受體對(duì)應(yīng)關(guān)系的組合：EVs 膜表面如果是 α6β4 和 α6β1則容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移；EVs 膜表面如果是 αvβ5 則容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。另外一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，無腫瘤的小鼠經(jīng)過外源性給予腫瘤來源的 EVs，研究者驚奇地發(fā)現(xiàn)這些經(jīng)過血液循環(huán)的 EVs 最后選擇性地扎根于某些特定的組織器官，這與兩百多年前腫瘤轉(zhuǎn)移的種子土壤學(xué)說奠基人 Paget 所觀察的現(xiàn)象有異曲同工之處。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：包含有胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的EVs 和胰腺癌細(xì)胞可溶性基質(zhì)的條件培養(yǎng)基分別被注射到大鼠體內(nèi)后，在胰腺癌最易發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝臟和骨組織中含有較高水平的腫瘤來源的 EVs；經(jīng)過比較分析發(fā)現(xiàn)含有巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的 EVs 能促進(jìn)肝臟 Kupffer 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TGF-β，TGF-β 又進(jìn)一步作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)纖黏連蛋白的分泌，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在肝臟的定植，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞傾向性地轉(zhuǎn)移到肝臟［28］。研究證實(shí)，低轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞攝入高轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的 EVs 能使其發(fā)生低轉(zhuǎn)移向高轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)變，說明腫瘤來源的 EVs 確實(shí)可以影響腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成進(jìn)而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移［29-30］。

腫瘤細(xì)胞來源的 EVs 也含有各種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維母細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等，可將其釋放到細(xì)胞外，作用于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面受體，導(dǎo)致血管形成并促進(jìn)腫瘤的遷移。Kim 等［31］研究表明，腫瘤細(xì)胞來源的 EVs 通過其攜帶的神經(jīng)鞘磷脂在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、侵襲和形成管腔，促進(jìn)新生血管形成。Hong 等［32］也報(bào)道結(jié)直腸癌細(xì)胞來源的 EVs 富含細(xì)胞周期相關(guān) mRNA，可以直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，可能形成新生腫瘤血管。同時(shí)，缺氧多形性膠質(zhì)瘤細(xì)胞來源的外泌體中的蛋白質(zhì)和 mRNA 在腫瘤微血管形成中發(fā)揮重要作用［33］。總之，EVs 可以改變受體細(xì)胞的生理狀態(tài)甚至能影響受體細(xì)胞周圍其他細(xì)胞的物質(zhì)代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并通過多條途徑影響腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

3.3胞外囊泡與能量代謝重編程

腫瘤細(xì)胞在不斷生長增殖的時(shí)候是處在一個(gè)酸性條件下，葡萄糖運(yùn)輸和糖酵解在腫瘤狀態(tài)下是被上調(diào)的，這樣就造成腫瘤微環(huán)境的酸性代謝產(chǎn)物不斷堆積導(dǎo)致酸中毒［34］。在酸中毒情況下，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生釋放的 EVs 會(huì)增多，使腫瘤細(xì)胞間通過 EVs 的交互通訊更加頻繁。Wang 等［35］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，酸中毒增加了 EVs 的釋放，并且被釋放出來的 EVs 膜表面的 RAB22A（一種小 GTP 酶，其表達(dá)依賴于 HIF）表達(dá)量也會(huì)顯著升高。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示 RAB22A 表達(dá)升高能進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的局部黏附和侵襲能力。因此，處于酸中毒條件下的腫瘤細(xì)胞更容易產(chǎn)生 EVs，從而增強(qiáng)細(xì)胞間的通訊，最終推動(dòng)了腫瘤的進(jìn)展。

3.4其他

關(guān)于 EVs 和腫瘤發(fā)展的機(jī)制還有其他多個(gè)方面的研究與猜測(cè)，如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）表型的獲得、腫瘤耐藥性的發(fā)生等［36］。不難發(fā)現(xiàn)，大部分關(guān)于 EVs 和腫瘤關(guān)系的研究都顯示腫瘤來源的 EVs 主要功能是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的。但是最近也不乏有相反作用研究結(jié)果的報(bào)道，如 Gabriel 等［37］報(bào)道從多種腫瘤細(xì)胞系獲得的 EVs 和從臨床前列腺癌患者血漿獲得的 EVs 中發(fā)現(xiàn)有功能活性的經(jīng)典抑癌蛋白 PTEN （phosphatase and tensin homolog），并且該含有 PTEN 蛋白的 EVs 確實(shí)能抑制受體腫瘤細(xì)胞（缺乏 PTEN 蛋白的細(xì)胞）的增殖能力，發(fā)揮腫瘤抑制作用。

4　展望

總而言之，以上研究強(qiáng)有力證實(shí)了腫瘤來源的 EVs 的確與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，并且大部分研究證實(shí)腫瘤來源的 EVs 主要促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，這就提示 EVs 可以作為臨床診斷治療腫瘤的有效突破口。近幾年，EVs 研究領(lǐng)域迅速發(fā)展，已經(jīng)成為國際研究熱點(diǎn)，尤其近幾年在國際上十分熱門的液體活檢技術(shù)的基本支柱之一就是腫瘤來源的EVs［38-39］；此外，EVs 本身就是一個(gè)良好的物質(zhì)運(yùn)輸載體，利用這個(gè)生物兼容性極好的運(yùn)輸載體，通過生物工程或者基因工程的方法可以將其裝載腫瘤預(yù)防用的疫苗，腫瘤治療用的化療藥物或者溶瘤病毒，甚至是基因治療用的基因產(chǎn)物［40］，提示臨床背景下的 EVs 研發(fā)尤為重要。由此可見，腫瘤來源的 EVs 是一個(gè)極有前景的領(lǐng)域，更深層次的理解腫瘤來源的 EVs 與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系將對(duì)開闊腫瘤治療視野，推進(jìn)精準(zhǔn)治療進(jìn)程有極其重要的意義。

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國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81372254）

100191 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系

黃晶，Email：huangjing82@bjmu.edu.cn

2016-05-31