陳　雯，賽文莉，楊緒莉，蔡　胤，顧娟娟，王　理，吳　瑋，姚登福△（南通大學(xué)附屬醫(yī)院：.檢驗(yàn)科；.臨床醫(yī)學(xué)研究中心；.醫(yī)學(xué)信息中心，江蘇南通600）

肺癌患者癌組織及血清缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)分析的臨床價(jià)值*

陳雯1，賽文莉2，楊緒莉2，蔡胤2，顧娟娟2，王理3，吳瑋2，姚登福2△
（南通大學(xué)附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.臨床醫(yī)學(xué)研究中心；3.醫(yī)學(xué)信息中心，江蘇南通226001）

目的檢測(cè)肺癌患者癌組織及血清缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)水平并分析其臨床價(jià)值。方法選取2012年1月至2015年2月該院收治的肺癌患者115例作為肺癌組，選取同期住院肺部感染的肺炎患者30例作為肺炎組、健康體檢者30例作為健康對(duì)照組。收集115例肺癌患者術(shù)后癌及癌旁組織標(biāo)本，提取總RNA分析組織核酸代謝水平；采用組織芯片和免疫組織化學(xué)法分析HIF-1α表達(dá)狀態(tài)與胞內(nèi)分布；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法定量檢測(cè)血清HIF-1α及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平。結(jié)果肺癌組患者血清HIF-1α水平［（138.3±28.8）μg/L］明顯高于健康對(duì)照組［（24.1±3.3）μg/L］和肺炎組［（58.8±14.5）μg/L］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且與血清VEGF水平呈顯著正相關(guān)（r=0.937，P＜0.01）；肺癌總RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)［（1.52±1.14）μg/mg］顯著高于癌周組織［（0.58±0.33）μg/mg］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.494，P＜0.01）；不同性別、腫瘤直徑、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肺癌組織HIF-1α表達(dá)陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論肺癌組織HIF-1α表達(dá)與組織核酸代謝水平和血管形成密切相關(guān)，且有助于肺癌的診斷與鑒別。

肺腫瘤/診斷；缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；核酸類/代謝；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

近年來，肺癌患者生存情況改善有限，確診后存活5年及以上者約為16%；Ⅰ期肺癌患者如及時(shí)手術(shù)治療10年生存率可達(dá)90%以上［1-2］。隨肺癌瘤體增大、耗氧量增加，組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）過表達(dá)，刺激血管形成等相關(guān)物質(zhì)表達(dá)［3］，且影響放、化療的療效，使癌細(xì)胞更具侵襲性［4-5］。組織缺氧與新血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）的相互關(guān)系值得探討，有可能成為影響肺癌患者預(yù)后的重要因素［6］。本研究分析了115例患者肺癌組織及血清HIF-1α表達(dá)狀態(tài)、臨床病理學(xué)特征及其與VEGF表達(dá)的相互關(guān)系和臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象選取2012年1月至2015年2月本院收治的肺癌患者115例，其中男58例，女57例；年齡39～77歲，中位年齡58歲；115例患者均有完整隨訪資料，符合2011年版肺癌診療規(guī)范。收集115例患者術(shù)后新鮮肺癌組織及癌旁組織（與癌組織距離大于3.0 cm且病理檢查無癌細(xì)胞）標(biāo)本，病理組織學(xué)檢查（蘇木精-伊紅染色）均為非小細(xì)胞肺癌，置-80℃保存。選取同期住院肺部感染的肺炎患者30例作為肺炎組、健康體檢者30例作為健康對(duì)照組，肝、腎功能，血脂，血糖等均正常。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.1.2主要試劑VEGF兔多克隆抗體（BA0407）、HIF-1α兔多克隆抗體（PB0245）和小鼠抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G-生物素標(biāo)記小鼠抗兔 IgG二抗（BM2004）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。二步法免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。

1.1.3主要儀器Bio-Ⅱ-A生物安全柜 EN-12469-2000型（西班牙Telstar公司），超低溫冰箱MDF-U71V型、KUBOTA高速冷凍離心機(jī)6900型（日本SANYO公司），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀TC-412型（英國(guó)Techne公司），PowerPac高電流電泳儀、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽、凝膠成像分析儀、核酸蛋白分析儀170-2525型（美國(guó)BIO-RAD公司），MegaBACE DNA測(cè)序儀等。

1.2方法

1.2.1肺組織總RNA制備及定量檢測(cè)精確稱取肺組織50 mg，置于無RNA酶勻漿器中。加入RNA快速制備試劑（MRC公司，USA）總RNA抽提試劑——TRIzol 1.0mL，勻漿2min，再按試劑盒說明書提取總RNA，采用核酸蛋白分析儀檢測(cè)260 nm波長(zhǎng)吸光度（A值），換算總RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即每毫克濕質(zhì)量肺癌組織中的總RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/mg），經(jīng)鑒定制備的RNA未被污染和降解后置于-80℃保存。

1.2.2cDNA合成、引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增及測(cè)序

1.2.2.1HIF-1α cDNA合成以第1鏈cDNA合成試劑盒（Fermentas公司）合成HIF-1α cDNA，按照試劑盒說明書操作。

1.2.2.2引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增按基因庫人HIF-1α序列（NM_001530），以PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，由上海英駿生物公司合成。引物HIF-1α（F）：5′-CTCATCCAAGAAGCCCTAAC-3′（nt2452-2471）；HIF-1α （R）：5′-TCATAACTGGTCAGCTGTGG-3′（nt2781-2800），擴(kuò)增片段349 bp。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，NM-002046）作為內(nèi)參，GAPDH（F）：5′-CACTGGCGTCTTCACCACCAT-3′（nt396-416）；GAPDH（R）：5′-GTGCAGGAGGCATTGCTGAT-3′（nt541-560），擴(kuò)增片段165 bp。取HIF-1α cDNA 1.0 μL，10 μmoL/L上、下游引物各1.0μL，PremixTaq DNA多聚酶（日本TaKaRa公司）12.5 μL，加雙蒸水（double distilled water，ddH2O）至20 μL，于94℃預(yù)變性5 min，94℃10 s、55℃30 s、72℃60 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后72℃10 min，4℃保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，掃描并拍照。

1.2.2.3DNA測(cè)序采用MontageTmDNA裝置（4℃，9 000 r/min離心10 min），以DYEnamic ET Dye末端循環(huán)測(cè)序試劑（美國(guó) Bioscienee公司）從目的凝膠制備DNA。將待測(cè)DNA 1.0 μg、2 pmol/μL測(cè)序引物2.5 μL、脫氟核糖核苷三磷酸混合試劑8.0 μL加ddH2O 20 μL。于95℃30 s后95℃20 s、50℃15 s、60℃1 min擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，15℃保存。經(jīng)醋酸銨、乙醇沉淀，采用Mega BACE DNA測(cè)序儀測(cè)序，應(yīng)用Mega BACE系統(tǒng)軟件（Version3.0）分析，并與GenBank源序列比對(duì)。

1.2.3組織芯片制備及免疫組織化學(xué)（免疫組化）法檢測(cè)構(gòu)建一個(gè)20×12點(diǎn)陣的組織芯片蠟塊，厚度為4 μm切片，并將其黏附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，以每一肺癌組織取4個(gè)點(diǎn)，非癌組織取2個(gè)點(diǎn)，對(duì)HIF-1α進(jìn)行免疫組化染色（S-P法）。按試劑盒說明書操作進(jìn)行免疫組化檢測(cè)：組織切片常規(guī)脫蠟及水化后以乙二胺四乙酸緩沖液沖洗后微波修復(fù)10 min，加入HIF-1α或VEGF一抗，室溫孵育1 h，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌3次后加入聚合體增強(qiáng)劑，室溫孵育20 min，PBS洗滌3次后再加入二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌3次后經(jīng)0.1%二氨基聯(lián)苯胺辣根過氧化物酶顯色5 min，自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。以0.01 mol/L PBS（pH=7.5）替代一抗、二抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4免疫組化結(jié)果判定結(jié)果判定以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比計(jì)分；以多數(shù)細(xì)胞染色特性計(jì)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比即某類細(xì)胞5個(gè)視野陽性細(xì)胞平均數(shù)：0～＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜75%為3分，≥75%為4分。將二者計(jì)分乘積作為免疫組化檢測(cè)結(jié)果，最終分為低表達(dá)（1～4分）、中表達(dá)（5～8分）、高表達(dá)（9～12分）。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法將50 mg濕質(zhì)量肺組織經(jīng)高速勻漿離心制備HIF-1α，采用2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉法定量檢測(cè)蛋白表達(dá)水平；在10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上加50 μg蛋白進(jìn)行常規(guī)電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，封閉。再加入鼠抗人HIF-1α抗體溶液或內(nèi)參肌動(dòng)蛋白抗體溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗溶液繼續(xù)孵育，最后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色并攝取照片。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清VEGF、HIF-1α水平采用ELISA KIT/96T檢測(cè)試劑盒（優(yōu)爾生，武漢）。VEGF（SEA143Hu，優(yōu)爾生，武漢）檢測(cè)范圍：15.63～1 000.00 pg/mL，HIF-1α（SEA798Hu，優(yōu)爾生，武漢）檢測(cè)范圍：0.156～10.000 ng/mL。按試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度（A值），根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算VEGF和HIF-1α水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用 Graphpad Prism5.0軟件和SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件繪圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析（One-Way ANOVA）；采用直線相關(guān)分析HIF-1α與VEGF表達(dá)的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1血清HIF-1α、VEGF水平及其相關(guān)性肺癌組患者血清HIF-1α水平顯著高于肺炎組和健康對(duì)照組，肺炎組患者血清HIF-1α水平顯著高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肺癌患者血清HIF-1α和VEGF水平明顯升高，若二者分別以100.0、280.0 μg/L作為臨界值，肺癌組陽性率分別為90.4%、99.1%，肺炎組分別為0、13.3%，健康對(duì)照組均無異常。肺癌患者血清HIF-1α水平與VEGF水平明顯相關(guān)（r=0.937，P＜0.01），見表1。

表1　血清HIF-1α、VEGF水平及其相關(guān)性

2.2肺癌組織及癌周組織HIF-1α基因和蛋白表達(dá)水平比較肺癌組織總RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)［（1.52±1.14）μg/mg］顯著高于癌周組織［（0.58±0.33）μg/mg］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.494，P＜0.01）；經(jīng)PCR擴(kuò)增基因片段大小為349bp，經(jīng)測(cè)序與GenBankHIF-1α源序列完全一致，見圖1。

圖1　肺癌組織及癌周組織HIF-1α基因和蛋白表達(dá)水平比較

2.3肺癌組織HIF-1α強(qiáng)勢(shì)表達(dá)組織芯片構(gòu)建圖可見組織點(diǎn)陣排列整齊，免疫組化S-P染色所有組織無掉片、移位，無組織扭曲，所取組織滿足分析。肺癌組織及癌圍組織HIF-1α表達(dá)呈深棕黃色，顆粒狀，主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。肺癌組織中HIF-1α表達(dá)較均勻，壞死區(qū)周圍及腫瘤浸潤(rùn)邊緣HIF-1α表達(dá)增多，靠近腫瘤邊緣被壓扁的組織中HIF-1α表達(dá)明顯。癌組織HIF-1α陽性表達(dá)、強(qiáng)度與計(jì)分均顯著高于癌周組織，見圖2。

圖2　肺癌組織及癌周組織HIF-1α蛋白表達(dá)的組織芯片分析

2.4肺癌組織HIF-1α表達(dá)的臨床病理學(xué)特征115例肺癌組織HIF-1α陽性87例（75.65%）；不同年齡、TNM分期和是否存活5年患者肺癌組織HIF-1α陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而不同性別、腫瘤直徑、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肺癌組織HIF-1α表達(dá)陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2　肺癌組織HIF-1α表達(dá)的臨床病理學(xué)特征（n=115）

3　討　論

肺癌預(yù)后的影響因素復(fù)雜，直接與患者早期癥狀不明顯、早期診斷技術(shù)缺陷、患者就診意識(shí)低等相關(guān)，肺癌確診時(shí)已基本屬于中、晚期，傳統(tǒng)治療方式為手術(shù)切除，放、化療［7］。血管期肺癌患者瘤內(nèi)出現(xiàn)新的毛細(xì)血管并促使腫瘤細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其中腫瘤血管來源于血管生成、血管套疊式生長(zhǎng)和內(nèi)皮祖細(xì)胞［8］。處于無血管期患者腫瘤細(xì)胞團(tuán)在缺氧等因素的作用下使瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生大量血管生成因子而誘導(dǎo)血管生成是肺癌生長(zhǎng)、進(jìn)展的關(guān)鍵［9］。本研究從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平分析了肺癌組織和血清HIF-1α表達(dá)水平與改變，評(píng)價(jià)了其對(duì)肺癌預(yù)后評(píng)估的臨床價(jià)值。

肺癌進(jìn)展與微環(huán)境及新血管生成密切相關(guān)。隨著肺癌細(xì)胞增殖、瘤體增大，癌組織中耗氧量顯著增加，造成缺氧致HIF-1α過表達(dá)，使癌細(xì)胞分泌血管生成因子而誘導(dǎo)血管生成。本研究結(jié)果顯示，肺癌患者若以血清HIF-1α＞100.0μg/L為臨界值，肺癌組陽性率為90.4%，肺炎組和健康對(duì)照組均未見異常；以血清VEGF＞280.0 μg/L為臨界值，肺癌組和肺炎組陽性率分別為99.1%、13.3%，HIF-1α和VEGF水平顯著升高且呈正相關(guān)，二者均是反映肺癌進(jìn)展和有助于診斷的血清學(xué)標(biāo)志物。在蛋白水平上顯示，肺癌組織HIF-1α陽性表達(dá)呈棕黃色，顆粒狀，主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；肺癌組織HIF-1α陽性率及表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于癌周組織，與文獻(xiàn)［10］研究結(jié)果一致；不同年齡、TNM分期和是否存活5年患者肺癌組織HIF-1α表達(dá)陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而不同性別、腫瘤直徑、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肺癌組織HIF-1α表達(dá)陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示HIF-1α基因可能是肺癌治療的有用靶目標(biāo)［11］。

綜上所述，本研究從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平探討了人肺癌組織和血清HIF-1α表達(dá)與改變，結(jié)果顯示，肺癌組織HIF-1α過表達(dá)調(diào)節(jié)了VEGF轉(zhuǎn)錄與新生血管生成，相互協(xié)同、依賴，形成正反饋機(jī)制，其水平進(jìn)行性增加可反映癌變的發(fā)生和進(jìn)展。肺癌組織HIF-1α和 VEGF過表達(dá)可分泌入血，檢測(cè)血清HIF-1α和VEGF水平有助于肺癌的診斷［12］；另外抑制HIF-1α表達(dá)或抑制VEGF與受體結(jié)合、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖將有助于肺癌的治療。

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Clinical values on analysis of cancerous tissue or circulating hypoxia-inducible factor-1α expression levels in patients with lung cancer*

Chen Wen1，Sai Wenli2，Yang Xuli2，Cai Yin2，Gu Juanjuan2，Wang Li3，Wu Wei2，Yao Dengfu2△（1.Department of Clinical Laboratory；2.Research Center of Clinical Medicine；3.Center of Medical Informatics，Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong University，Nantong，Jiangsu 226001，China）

ObjectiveTo investigate the hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）expression levels in cancer tissue and serum of the patients with lung cancer and to analyze its clinical values.MethodsTotally 115 patients with lung cancers in our hospital from January 2012 to February 2015 were selected as the lung cancer group，contemporaneous 30 cases of pneumonia as the pneumonia group and 30 individuals undergoing the physical examination as the control group.The postoperative cancerous and paracancerous tissues in 115 cases of lung cancer were collected for extracting total RNA and analyzing the tissue nucleic acid metabolic level The status of tissue HIF-1α expression and intercellular distribution were observed by adopting the tissue microarray with immunohistochemistry.The serum HIF-1α and VEGF levels were detected by using the enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsThe serum HIF-1α level in the lung cancer group was（138.3±28.8）μg/L，which was significantly higher than（24.1±3.3）μg/L in the control group and（58.8±14.5）μg/L in the pneumonia group，the differences were statistically significant（P＜0.01），moreover had significant positive correlation with serum VEGF level（r=0.937，P＜0.01）.The total RNA mass fraction in lung cancer was（1.52±1.14）μg/mg，which was significantly higher than（0.58±0.33）μg/mg in the paracancer ous tissue，the difference was statistically significant（t=8.494，P＜0.01）；the lung cancer tissue HIF-1α expression positive rate had statistical differences among difference genders，tumor sizes，differentiation degrees and whether having lymph node metastasis，the differences were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionLung cancer tissue HIF-1α expressions is closely correlated to the tissue nucleic acid metabolic level and angiogenesis，moreover is helpful to the diagnosis and identification of lung cancer.

Lung neoplasms/diagnosis；Hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit；Nucleic acids/metabolism；Enzyme-linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.06.002

A

1009-5519（2016）06-0804-04

江蘇省“六大人才”項(xiàng)目（WSW-011）；南通市應(yīng)用研究科技計(jì)劃項(xiàng)目（BK2013048）。

陳雯（1966-），副主任檢驗(yàn)師，主要從事惡性腫瘤早期診斷的研究。

△，E-mail：yaodf@ahnmc.com。

（2015-12-18）