屈素潔，鄒聯(lián)斌，胡　杰，粟艷瓊，尹彥文，陸文俊，李　軍，施開(kāi)創(chuàng)，莫?jiǎng)偬m（廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧　530001）

雞傳染性支氣管炎病毒廣西株N基因的克隆與序列分析

屈素潔，鄒聯(lián)斌，胡杰，粟艷瓊，尹彥文，陸文俊，李軍，施開(kāi)創(chuàng)，莫?jiǎng)偬m
（廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧530001）

參照GenBank中雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的核酸序列設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，利用 RT-PCR 擴(kuò)增了1個(gè)廣西分離株的N基因cDNA片段，并將其克隆到pMDl8-T載體中。序列分析結(jié)果表明，N基因序列全長(zhǎng)為1 230 bp，編碼1條409個(gè)氨基酸組成的多肽；分離株與國(guó)內(nèi)外IBV參考毒株相比，核苷酸同源性為83.8%～99.9%，氨基酸同源性為88.4%～99.6%；分離株與LX4株、BJ株關(guān)系較近，與疫苗株處于不同的進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，是新的IBV變異株。

雞傳染性支氣管炎病毒；N 基因；基因克?。恍蛄蟹治?/p>

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的雞的一種急性高度接觸傳染性呼吸道疾病，各日齡雞均可感染， 主要侵害呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)，是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一［1-3］。該病毒的特點(diǎn)是變異頻繁，血清型復(fù)雜，所致疾病的臨床表現(xiàn)差異很大。該病毒不同血清型間沒(méi)有或僅有部分交叉免疫性，單一血清型疫苗只能對(duì)同型IBV 感染產(chǎn)生免疫力，對(duì)異型毒株只能提供部分保護(hù)力或根本無(wú)保護(hù)力，容易導(dǎo)致免疫失敗，所以根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍械难逍瓦x擇疫苗尤為重要［4］。

IBV是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒。該病毒基因組的高突變性，導(dǎo)致了新基因型和變異株不斷出現(xiàn)［5-6］。IBV含有3種主要結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）和核蛋白（N）。N 蛋白作為主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，是IBV誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要免疫原［7］，其主要功能是包裹核酸，使之易于裝配于核衣殼中。本研究對(duì)1株IBV廣西分離株進(jìn)行了N基因全序列的測(cè)定和分析，以期為我國(guó)IBV的分子流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和雞胚。IBV廣西分離株（Guangxi156）為本實(shí)驗(yàn)室2014年從廣西某地采集的，大量可疑組織病料中分離出來(lái)的1株具有一定地方代表性的毒株，由廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存；SPF雞胚由廣東華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供。

1.1.2 試劑。RNA提取試劑盒、TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0 、 膠 回 收 試 劑 盒、pMDl8-T Simple Vector，均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DH5α感受態(tài)，購(gòu)自Tiangen；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

參照GenBank中IBV的N基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物N1、N2，用于擴(kuò)增N基因全長(zhǎng)。引物由大連寶生物公司合成，序列為：N1：5'-TGTCA TGGCAAGCGGTAAGG-3'；N2：5'-TACTCAAAGTTCA TTCTCTC -3'。

1.3 IBV的增殖及其RNA的提取

將Guangxi156株接種10日齡SPF雞胚，37 ℃培養(yǎng)36 h后（棄24 h內(nèi)死胚），無(wú)菌收集尿囊液，4 ℃、5 000 r/min 離心30 min，取上清液，27 000 r/min 離心2 h，棄去大部分上清液（管底留大約1 mL），吹打混勻，即得病毒液。取病毒200 μL，用RNA提取試劑盒提取病毒總RNA，操作方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 病毒N基因的RT-PCR擴(kuò)增

1.4.1 N基因cDNA的合成。按TaKaRa公司提供的TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 N基因cDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：5×PCR buffer 10 μL，TaKaRa Ex Taq 0.25 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA模板10 μL，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物5～10 μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 N基因克隆、鑒定和測(cè)序

產(chǎn)物純化連接pMDl8-T載體后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定。以重組質(zhì)粒為模板，N1、N2為引物，對(duì)所提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 N基因序列同源性比較與進(jìn)化樹(shù)分析

將測(cè)得的N基因核苷酸序列及據(jù)其推導(dǎo)的氨基酸序列，與GenBank中收錄的H120、H52、D41、W93、ZJ981、SD0612、Ark99、LX4、BJ、K069 -01、CU-T2、Gray、Beaudette、TW97-4、D1466、Vic S、M 41 （GenBank 登錄號(hào)分別為AY028296、AF35231、AY846837、AY842861、GQ149079、EU362620、M85244、A Y338732、A Y31965、A Y790344、U498558、M85245、NC-00145、NC-001451、A Y363965、U52594、DQ834384）等17個(gè)IBV毒株 N 基因的核苷酸及其編碼的氨基酸序列，用 DNAStar和BLAST 軟件進(jìn)行同源性比較及序列分析。

2　結(jié)果

2.1 N基因的RT-PCR擴(kuò)增

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，N基因的RT-PCR產(chǎn)物大小約1.2 kb，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符（圖1）。

2.2 N基因克隆與鑒定

將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)出1條約1.2 kb的片段，與RT-PCR結(jié)果相一致，表明目的基因已克隆到質(zhì)粒載體上。

2.3 N基因的克隆測(cè)序及序列分析比較

將挑選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng)拼接后得到IBV廣西分離株N基因的ORF全核苷酸序列。將獲得的Guangxi156株的N基因序列提交GenBank，序列登錄號(hào)為KT002188。N基因ORF全長(zhǎng)1 230 bp，編碼409個(gè)氨基酸。與國(guó)內(nèi)外IBV參考株進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)分離株與國(guó)內(nèi)外IBV參考株的核苷酸序列同源性為83.8%～99.9%，其中與BJ株的同源性最高，為93.3%，與疫苗株H120、H52等的同源性較低，在97.2%～88.5% 之間。分離株與國(guó)內(nèi)外IBV參考毒株的氨基酸同源性在88.4%～99.6%之間（圖2）。與17株參考毒株的N基因序列相比，Guangxi156株無(wú)堿基的缺失和插入現(xiàn)象，但存在基因突變，在228、281、320、322aa有4個(gè)半胱氨酸（Cys）。另外，N 蛋白內(nèi)部還2個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。

圖1　N基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2　IBV廣西分離株與參考株N基因氨基酸同源性比較（%）

2.4 N基因的進(jìn)化分析

根據(jù)IBV N基因的核苷酸差異性，將Guangxi156株與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的17個(gè)毒株建立遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，Guangxi156株與國(guó)內(nèi)的LX4株和BJ株關(guān)系較近，與其余IBV毒株的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，表明分離株可能為變異株（圖3）。

圖3　IBV N 基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)

3　討論

近年來(lái)，我國(guó)IB流行呈上升趨勢(shì)，尤其是腎型、腺胃型IB已蔓延到許多地區(qū)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，一般都采用弱毒疫苗對(duì)IB進(jìn)行免疫預(yù)防，而自然條件下疫苗毒株與野生毒株之間可發(fā)生重組，因此IB 已成為養(yǎng)禽業(yè)最難控制的疫病之一。早期的分子生物學(xué)研究認(rèn)為，IBV的變異主要發(fā)生于S1 基因，而N基因則相對(duì)保守，尤其是中間區(qū)域［8］。但近年來(lái)的報(bào)道表明，類(lèi)似于S1基因，N基因也存在缺失和插入等變異現(xiàn)象，其中有些變異可能存在于N蛋白某些抗原表位及功能區(qū)域，從而可能改變病毒的某些生物學(xué)特性［9-13］。因此，N 基因分子特征研究對(duì) IBV 遺傳衍化及分子流行病學(xué)的研究具有重要的作用。

本試驗(yàn)對(duì)IBV分離株Guangxi156的N基因進(jìn)行了克隆和序列測(cè)定，并將序列與 GenBank中公布的17株IBV 序列的N基因進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，Guangxi156株 N 基因長(zhǎng)度為1 230 bp，編碼409個(gè)氨基酸殘基，不存在基因的插入和缺失，但存在遍及整個(gè)N基因的散在點(diǎn)突變，在228、281、320、322aa有4個(gè)半胱氨酸（Cys）。這與文獻(xiàn)報(bào)道的相同，說(shuō)明半胱氨酸位置與數(shù)目、N 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有著十分密切的關(guān)系。它們的改變可能直接影響到N蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。另外，N 蛋白內(nèi)部含2個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。分離株與國(guó)內(nèi)外IBV 參考株的核苷酸序列同源性為83.8%～99.9%，其中與BJ株的同源性最高，為93.3%，與疫苗株H120、H52等的同源性較低，在97.2%～88.5%之間。分離株與國(guó)內(nèi)外IBV參考毒株氨基酸的同源性在88.4%～99.6%之間。本研究對(duì)IBV廣西分離株的N糖蛋白的基因序列進(jìn)行遺傳發(fā)育進(jìn)化樹(shù)繪制，表明Guangxi1566株與國(guó)內(nèi)的LX4、BJ和SD0612株關(guān)系較近，與其余IBV毒株的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，表明分離株可能是國(guó)內(nèi)流行的雞腎型IBV的1個(gè)新變異株。本研究對(duì)IBV廣西分離株N基因進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，為IBV廣西分離株遺傳變異分析和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了重要材料，也為IBV綜合防制措施的制訂提供了依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Cloning and Sequence Analysis on N Gene of an Infectious Bronchitis Virus Guangxi Isolate

Qu Sujie，Zou Lianbin，Hu Jie，Su Yangqiong，Yin Yanwen，Lu Wenjun，Li Jun，Shi Kaichuang，Mo Shenglan
（Guangxi Center for Animal Disease Control and Prevention，Nanning，Guangxi 530001）

One pair of primers for amplifying the N gene of IBV based on the sequence in GenBank was designed. The cDNA fragments of N gene of IBV strain isolated from Guangxi province were amplified by RT-PCR，then the amplified fragments were cloned into pMDl8-T vector and the recombinant plasmids were sequenced. The results showed that the N gene from all of the IBV isolates consisted of 1230 bp，coding for 409 amino acid. Compared with that of the other published IBV N genes，the homology of nucleotide and amino acid sequence of the isolate were 83.8%～99.9% and 88.4%～99.6% respectively. The isolate strain was closely related to LX4 and BJ and had relatively distant phylogentic relationship with the immune strain which was grouped in other clade. These results suggested that the isolate was a new variant of IBV.

avian infectious bronchitis virus；N gene；genetic cloning；sequence analysis

S852.65

A

1005-944X（2016）08-0082-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.023

廣西區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技項(xiàng)目（桂漁牧科1204935）

莫?jiǎng)偬m