劉洪明，王官曉，王俊卿，楊玉華，郭善娜，徐曉靜（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州　730070；.山東省煙臺(tái)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺(tái)　64000）

教材講義連載

兩種不同刺激劑對(duì)雞淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

劉洪明1，2，王官曉2，王俊卿2，楊玉華2，郭善娜2，徐曉靜2
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州730070；2.山東省煙臺(tái)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺(tái)264000）

［目的］比較不同刺激劑刀豆素A（Con A）和植物凝素（PHA）對(duì)雞淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。［方法］首先，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離健康雞的外周血淋巴細(xì)胞，應(yīng)用2種不同的刺激劑Con A和PHA刺激48 h后收集細(xì)胞，抽提刺激培養(yǎng)細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄。其次，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)不同刺激劑對(duì)雞淋巴細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。最后，用分子生物學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。［結(jié)果］分離到純度和活細(xì)胞較高的雞淋巴細(xì)胞。熒光定量PCR結(jié)果顯示 ：Con A刺激的淋巴細(xì)胞因子表達(dá)量比PHA刺激細(xì)胞的表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；PHA刺激的細(xì)胞因子除IL-4的表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）外，其他細(xì)胞因子表達(dá)量無(wú)明顯升高（P＞0.05）。［結(jié)論］Con A刺激淋巴細(xì)胞后，可以提高細(xì)胞因子的表達(dá)，刺激效果優(yōu)于PHA。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步體外研究雞淋巴細(xì)胞及其功能提供了方法。

雞T細(xì)胞；細(xì)胞因子；熒光定量PCR

T淋巴細(xì)胞是主要的淋巴細(xì)胞，其分泌的細(xì)胞因子不僅可以直接參與機(jī)體免疫反應(yīng)，還能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能。根據(jù) CD4和CD8分子表達(dá)，可將成熟T細(xì)胞分為CD4+或 CD8+細(xì)胞，其中CD4+細(xì)胞可根據(jù)表達(dá)細(xì)胞因子的不同分為T(mén)h1和Th2細(xì)胞［1］。Th1與抗胞內(nèi)感染相關(guān)，主要分泌IFN-γ、IL-2細(xì)胞因子。IFN-γ可以提高嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高NK細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性的殺傷作用［2］，表現(xiàn)出抗腫瘤、抗病毒活性，促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)［3］；Th2輔助體液免疫反應(yīng)［4］，主要分泌IL-4、IL-10、IL-12等細(xì)胞因子。其中IL-4是促進(jìn)T細(xì)胞向Th2分化的重要細(xì)胞因子。IL-4作為T(mén)h2細(xì)胞的特征細(xì)胞因子，可以促炎、活化B細(xì)胞、促Th2細(xì)胞活化，臨床上顯示有抗腫瘤和緩解自身免疫性疾?。ㄈ珙?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）的作用［5］。IL-10是一種重要抗炎癥因子，是一種多效細(xì)胞因子，可以刺激B細(xì)胞的增殖和穩(wěn)定，以及MHCⅡ的表達(dá)、IgA和IgG的分泌，增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞的發(fā)育。其抑制作用表現(xiàn)為在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)時(shí)，抑制免疫細(xì)胞活性，降低表達(dá)的免疫分子產(chǎn)量，從而使免疫系統(tǒng)及個(gè)體水平保持平衡［6］。IL-12的主要生物學(xué)活性包括：對(duì)T細(xì)胞、NK細(xì)胞及造血細(xì)胞的促進(jìn)作用，誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞之間的平衡，通過(guò)誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生起到抗病毒及抗腫瘤作用［7］。Con A和PHA是常用的T細(xì)胞刺激劑，可以刺激細(xì)胞的增殖和分型，已廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物、禽類(lèi)、水生動(dòng)物等［8-10］，對(duì)體外培養(yǎng)和研究T細(xì)胞具有重要作用。有研究表明Con A和PHA還可以用來(lái)篩選細(xì)胞免疫缺陷，且Con A效果優(yōu)于PHA［11］。兩種刺激劑均可以很好地刺激T細(xì)胞增殖，但是對(duì)細(xì)胞增殖后細(xì)胞因子表達(dá)不清楚。本實(shí)驗(yàn)用兩種刺激劑對(duì)雞淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激，用熒光定量方法檢測(cè)刺激后T細(xì)胞因子的表達(dá)，為進(jìn)一步研究雞淋巴細(xì)胞提供了方法。

1　材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司； 植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（Con A），購(gòu)自Sigma公司；雞外周血淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆籖NAiso Plus（Total RNA提取試劑），購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA remover，購(gòu)自TOYOBO公司；寡核苷酸引物，由華大基因合成；GoTaq? qPCR Master Mix，購(gòu)自北京Promega公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。15日齡公雞，購(gòu)自安徽某雞場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 雞外周血淋巴細(xì)胞分離和成活率檢測(cè)。取雞抗凝血5 mL，在50 mL離心管中加入等體積的雞外周血淋巴細(xì)胞分離液；將血液樣本緩慢加于分離液之液面上，18～22 ℃，400 g 離心20 min， 棄上清液；用吸管小心吸取分離液層及淋巴細(xì)胞層，置于另一新離心管（50 mL）內(nèi)，加入10 mL 細(xì)胞洗滌液混勻，250 g離心10 min，棄上清；用吸管以5 mL細(xì)胞洗滌液重懸所得細(xì)胞，250 g離心10 min，棄上清，得下層細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞懸液按照1：20稀釋5個(gè)細(xì)胞孔，每孔100 μL。每孔加入10 μL 0.4%的臺(tái)盼藍(lán)，3分鐘后顯微鏡下分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞率（%）=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.2 細(xì)胞收集計(jì)數(shù)并接種培養(yǎng)細(xì)胞。用含10% FBS（體積）的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×106/mL；將細(xì)胞分為3份，分別加入不同的刺激劑Con A、PHA（濃度均為5 mg/mL）調(diào)整刺激劑的終濃度為12.5 μg/mL，并設(shè)置陰性對(duì)照；接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2條件下，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成。用冷PBS （pH7.4）洗滌細(xì)胞3次；按試劑盒的操作說(shuō)明，分離獲得細(xì)胞的總mRNA；檢測(cè)其D260nm/ D280nm比 值和D260nm/D230nm比值， 并將mRNA的質(zhì)量調(diào)整至0.5 pg～0.5 ng之間。按mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，合成第一鏈cDNA。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。以獲得的cDNA為模版進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。Nuclease-Free Water 7.2 μL，上游引物（10 μM）0.4 μL，下游引物（10 μM）0.4 μL，GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL，cDNA（模板）2 μL，稀釋cDNA（模板）濃度為40 ng/μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增步驟依次為 95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。在60 ℃時(shí)收集熒光，總反應(yīng)體積為20 μL。

1.2.5 熒光定量PCR結(jié)果的計(jì)算。采用比較CT法（ΔΔCT），相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT=2-（ΔCT處理-ΔCT對(duì)照）=2-［（CT處理-CT內(nèi)參）-（CT對(duì)照-CT內(nèi)參）］，數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值［12］。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 11.5軟件分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著意義。設(shè)置未刺激的淋巴細(xì)胞為陰性對(duì)照，細(xì)胞為對(duì)照樣品。將對(duì)照樣品mRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1，試驗(yàn)樣品的2-ΔΔCT值即為相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1 所分離到的外周血活淋巴細(xì)胞數(shù)較多

對(duì)分離的雞淋巴細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，結(jié)果成活的淋巴細(xì)胞抗臺(tái)盼藍(lán)，細(xì)胞透亮，死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，不透明。顯微鏡觀察顯示，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)透亮細(xì)胞的數(shù)目均大于95%。這說(shuō)明所獲得的淋巴細(xì)胞完全能夠滿(mǎn)足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 淋巴細(xì)胞中抽提的RNA完整性好

對(duì)Con A、PHA刺激和陰性對(duì)照細(xì)胞中提取的總RNA，經(jīng)超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)，結(jié)果未刺激淋巴細(xì)胞RNA濃度為230 mg/μL，D260nm/ D280nm比值均為1.8，D260nm/D230nm比值均大于2.2。Con A刺激的淋巴細(xì)胞濃度為190 mg/μL，D260nm/D280nm比值均為1.9，D260nm/D230nm比值均大于2.1；PHA刺激的淋巴細(xì)胞濃度為220 mg/μL，D260nm/D280nm比值均為1.8，D260nm/ D230nm比值均大于2.2。這表明mRNA純度較高，經(jīng)1.0%瓊脂糖核酸膠電泳顯示，RNA完整度較高（圖1），可以用于后續(xù)的cDNA合成。

2.3 不同刺激后細(xì)胞因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量

以未刺激淋巴細(xì)胞作為對(duì)照組，參照值設(shè)為1。 Con A刺激下，IL-4、IL-10、IFN-γ的相對(duì)表達(dá)含量極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）增加，分別為10.3、1.66、1.73，IL-12為1.88±0.86差異不顯著（P＞0.05）；在PHA刺激下，IL-4相對(duì)表達(dá)含量增加為5.24，與未刺激淋巴細(xì)胞組差異極顯著（P＜0.01），IL-10、IL-12、IFN-γ的相對(duì)表達(dá)含量分別為0.74、0.94、1.11，差異不顯著（P＞0.05）。具體數(shù)值見(jiàn)表1。

表1　刺激劑刺激和未刺激細(xì)胞因子的mRAN表達(dá)量

3　討論

PHA主要成分為植物多肽，屬高分子糖蛋白類(lèi)，有促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂的作用，能激活小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，繼而分裂增殖，釋放淋巴因子。Con A是四聚體球蛋白，是一種凝集素，具有強(qiáng)力的促有絲分裂作用，有較好的促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)作用，能選擇性激活抑制性T淋巴細(xì)胞［13］。PHA、Con A都是常用的有絲分裂原，可在一定濃度范圍內(nèi)刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，從而使其增殖分化，發(fā)揮相應(yīng)細(xì)胞功能。本實(shí)驗(yàn)將刺激劑濃度設(shè)為12.5 μg/mL，可有效刺激T細(xì)胞的分化［14-16］。Con A和PHA與T淋巴細(xì)胞受體結(jié)合時(shí)，如果細(xì)胞過(guò)多，由于生長(zhǎng)空間有限，刺激劑就只能與一部分細(xì)胞的受體結(jié)合，刺激這部分細(xì)胞活化；如果細(xì)胞過(guò)少，T淋巴細(xì)胞僅占淋巴細(xì)胞的一小部分，由于受體數(shù)量有限，使刺激劑的結(jié)合率降低，部分刺激劑未發(fā)揮作用，T淋巴細(xì)胞增殖的效率就降低。因此將細(xì)胞密度調(diào)整為4×106/mL。

由結(jié)果可知，Con A刺激后，IL-4、IL-10、IFN-γ的相對(duì)表達(dá)含量顯著增加。IL-12增加量雖未有顯著性意義，但其平均值（1.88）依舊高出陰性對(duì)照；PHA刺激后，僅有IL-4的相對(duì)表達(dá)量極顯著增加，IL-10、IL-12、IFN-γ皆無(wú)顯著差異。由此可得出Con A刺激后的細(xì)胞因子表達(dá)效果優(yōu)于PHA。這可能是由于有絲分裂原Con A在刺激淋巴細(xì)胞因子方面具有優(yōu)勢(shì)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Effect of Two Kinds of Stimuli on Cytokines Secreted by Chicken Peripheral Blood Lymphocytes

Liu Hongming1，2，Wang Guanxiao2，Wang Junqing2，Yang Yuhua2，Guo Shanna2，Xu Xiaojing2
（1.Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730070；2.Yantai Animal Health Inspection Institution，Yantai，Shandong 264000）

［Objective］ To compare the effect of two kinds of stimuli，concanavalin A（Con A）and phytohemagglutinin（PHA）on cytokine secreted by chicken lymphocyte. ［Methods］ First，peripheral blood lymphocytes from chickens were separated by lymphocyte separation liquid and cultured with Con A and PHA for 48 h，respectively，then the cell RNAs were extracted and the reverse transcription was carry out. Secondly，a real time PCR was performed for detection of the RNA transcription level in the chicken lymphocytes stimulated by Con A and PHA. Finally，the effect of two kinds of stimuli on cytokines secretion was compared with molecular biology software. ［Results］ Chicken lymphocytes with higher purity and a survival rate were obtained with the used method. The transcription levels of tested cytokines stimulated by Con A were evidently higher than that by PHA（P ＜ 0.01）. Moreover，PHA could not increase cytokine transcription levels（P＞0.05）except of IL-4（P ＜ 0.01）. ［Conclusion］ Con A can enhance the transcription levels of cytokine genes and is a be better stimulus for chicken lymphocytes than PHA. All these results provide methods for the further study of chic ken lymphocytes in vitro.

chicken T cell；cytokine；fluorescence quantitative PCR

S831

B

1005-944X（2016）08-0090-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.025

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31201888）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31572496）