樊曉旭，趙永剛，李　林，吳曉東，王志亮（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，外來(lái)病研究中心，山東青島　266032）

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在疾病快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展

樊曉旭，趙永剛，李林，吳曉東，王志亮
（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，外來(lái)病研究中心，山東青島266032）

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，在保證靈敏、特異的同時(shí)，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，能夠在常溫下10～20分鐘內(nèi)對(duì)靶DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、資源的要求低，適用于獸醫(yī)、食品安全、生物防御、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的快速診斷。本文介紹了該技術(shù)的原理及目前在病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等病原檢測(cè)方面的應(yīng)用，展望了其現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面的應(yīng)用前景。

重組酶聚合酶擴(kuò)增；快速診斷；應(yīng)用

1　引言

1985年，美國(guó)PE-Cetus公司發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。該原理類(lèi)似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，反應(yīng)通過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟，在基于靶序列兩端互補(bǔ)的特異性寡核苷酸引物參與下，實(shí)現(xiàn)DNA的體外合成和擴(kuò)增?，F(xiàn)在，由英國(guó)TwistDx Inc公司開(kāi)發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），對(duì)核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)［1］。相比經(jīng)典PCR技術(shù)，RPA技術(shù)主要優(yōu)勢(shì)之一在于等溫。常規(guī)PCR必須經(jīng)過(guò)不同溫度環(huán)節(jié)，而RPA反應(yīng)在常溫下即可進(jìn)行反應(yīng)，甚至人體體溫即可提供反應(yīng)所需的溫度環(huán)境，其最適溫度在37～42 ℃。優(yōu)勢(shì)之二在于檢測(cè)耗時(shí)短。整個(gè)過(guò)程在10～20分鐘內(nèi)即可完成，且無(wú)需變性，不僅大大縮短了檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間，也無(wú)需與PCR儀類(lèi)似的專(zhuān)門(mén)溫控設(shè)備，從而實(shí)現(xiàn)了便攜式快速核酸檢測(cè)。優(yōu)勢(shì)之三在于靈敏。RPA技術(shù)在縮短反應(yīng)時(shí)間的同時(shí)也保持了高靈敏性，從單個(gè)模板分子可得到大約1012數(shù)量級(jí)的擴(kuò)增產(chǎn)物。優(yōu)勢(shì)之四在于結(jié)果讀取多樣化。RPA結(jié)果可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，也可類(lèi)似real-time PCR對(duì)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，還可以通過(guò)試紙條（側(cè)流層析試紙條LFD）讀取結(jié)果。本文擬從RPA技術(shù)的原理、在疾病快速檢測(cè)中的應(yīng)用方面作一綜述。

2　原理

2.1 擴(kuò)增原理

RPA反應(yīng)中，重組酶首先與上下游引物結(jié)合，尋找同源的雙鏈DNA，一旦定位，發(fā)生鏈交換，單鏈綁定蛋白（SSB）與親本鏈綁定，阻止其與脫離的模板鏈發(fā)生相互作用。接著，DNA聚合酶從上下游引物的3'端啟動(dòng)模板合成，形成兩條雙鏈DNA，如此循環(huán)重復(fù)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增［2］（圖1）。若引入逆轉(zhuǎn)錄酶，建立RT-RPA方法，也適用于RNA的快速檢測(cè)。

圖1　重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)機(jī)理［2］

2.2 引物、探針設(shè)計(jì)

在引物設(shè)計(jì)上，RPA與PCR類(lèi)似，但差異之處在于引物的長(zhǎng)度、序列組成和選取標(biāo)準(zhǔn)。RPA引物在長(zhǎng)度上通常至少為30～35 bp，這是由于單鏈綁定蛋白需要寡核苷酸長(zhǎng)度在30～35 bp以上才能將其整合到雙鏈DNA［3］。所擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度通常在500 bp以內(nèi)，以100～200 bp為宜，可保證檢測(cè)的敏感性和反應(yīng)速度。此外，RPA引物的序列組成有著特定的要求：5'端3～5個(gè)核苷酸應(yīng)當(dāng)避免出現(xiàn)多個(gè)G；在3'端應(yīng)有GC；避免連續(xù)出現(xiàn)多個(gè)相同核苷酸；GC含量占30～70%；避免引物形成二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)。3'端錯(cuò)配數(shù)超過(guò)一個(gè)堿基，會(huì)阻礙RPA反應(yīng)的進(jìn)行。在引物兩端和中心有3個(gè)堿基發(fā)生錯(cuò)配，則會(huì)影響RPA的檢測(cè)效率。RPA實(shí)驗(yàn)中的探針長(zhǎng)度約為46～52個(gè)核苷酸，在3'端設(shè)計(jì)阻斷物，如C3-間隔、磷酸鹽、胺、生物素四乙二醇（BTG）等，抑制DNA鏈的延伸。探針內(nèi)部添加了切割位點(diǎn)，可供exo、nfo、fpg酶切割。只有當(dāng)探針與模板DNA呈綁定狀態(tài)，才發(fā)生切割。探針的切割位點(diǎn)距離5'端至少30個(gè)堿基，距離3'端至少15個(gè)堿基。

2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方式

目前，TwistAmp basic kit試劑盒可采用瓊脂糖凝膠電泳方法讀取結(jié)果；TwistAmp exo/fpg kit 和TwistAmp nfo kit可分別通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量和側(cè)流層析試紙條方式讀取結(jié)果，上述兩類(lèi)試劑盒與TwistAmp basic kit相比，實(shí)際應(yīng)用更為廣泛。

在實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)中，TwistAmp exo探針內(nèi)部切割位點(diǎn)側(cè)面有dT-熒光發(fā)光基團(tuán)，與dT-淬滅基團(tuán)相對(duì)應(yīng)。探針上具有四氫呋喃（THF）殘基，可供大腸桿菌核酸外切酶III（exo酶）識(shí)別，切割分離熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生并積累熒光信號(hào)，供便攜式熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，通過(guò)exo識(shí)別THF，釋放3'端阻斷物，在Bsu聚合酶作用下開(kāi)始從3'端延長(zhǎng)擴(kuò)增。

在TwistAmp nfo實(shí)驗(yàn)中，探針上的四氫呋喃（THF）殘基由大腸桿菌核酸內(nèi)切酶IV（nfo酶）識(shí)別，抗熒光標(biāo)記的金納米顆粒與熒光團(tuán)結(jié)合；通過(guò)綁定鏈霉親和素，還可檢測(cè)到在下游引物5'端標(biāo)記的生物素，由此可通過(guò)側(cè)流層析試紙條檢測(cè)到標(biāo)記的雙鏈（圖2）。

圖2　重組酶聚合酶擴(kuò)增不同的檢測(cè)方法［2］

3　應(yīng)用

以PubMed（NLM）數(shù)據(jù)庫(kù)為例，按關(guān)鍵詞“Recombinase Polymerase Amplification”進(jìn)行題目檢索，可檢索到相關(guān)文獻(xiàn)共63篇。其中，2010年1篇、2011年1篇、2012年3篇、2013年6篇、2014年19篇、2015年21篇，2016年截至5月11篇。從2010—2016年平均每月發(fā)表的文章數(shù)量可以看出，總體上，RPA相關(guān)研究數(shù)呈上升趨勢(shì)（圖3）。研究包括了對(duì)感染動(dòng)植物的病原微生物檢測(cè)，如病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、鉤端螺旋體、衣原體等。

圖3　RPA相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表情況（截至2016年5月）

3.1 病毒檢測(cè)

在病毒檢測(cè)方面，RPA被應(yīng)用到嬰兒艾滋病毒感染的檢測(cè)中，無(wú)需復(fù)雜的儀器，在20分鐘內(nèi)即可檢測(cè)低拷貝量的HIV-1亞型前DNA，同時(shí)增加了逆轉(zhuǎn)錄（RT）RPA反應(yīng)，可檢測(cè)HIV-1 RNA，方法敏感、快速、操作簡(jiǎn)便［4］。在31～43℃溫度范圍內(nèi)，可保證RPA-HIV技術(shù)的檢測(cè)效果，適于撒哈拉以南非洲地區(qū)戶外使用。Yehia 等針對(duì)埃及禽流感病毒流行株，在H5基因HA2片段970 bp，設(shè)計(jì)了三條上游引物、三條下游引物、一條exo探針。開(kāi)發(fā)H5RT-RPA方法可在7分鐘檢測(cè)到單個(gè)RNA分子，而實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法耗時(shí)至少90分鐘，實(shí)時(shí)RT-LAMP技術(shù)也需要30～60分鐘。在保證敏感性和特異性的同時(shí)，RPA較其他檢測(cè)方法縮短了反應(yīng)時(shí)間［5］。針對(duì)犬細(xì)小病毒2型（CPV-2）VP2基因保守區(qū)片段（約210 bp）開(kāi)發(fā)了RPA檢測(cè)方法，反應(yīng)可在等溫水浴中進(jìn)行，在資源有限的環(huán)境下可作為犬細(xì)小病毒檢測(cè)潛在的替代方法［6］。針對(duì)4個(gè)血清型DENV 3'UTR保守區(qū)，設(shè)計(jì)的引物和探針，建立RT-RPA方法，相比RT-LAMP、RT-qPCR，RT-RPA表現(xiàn)出良好的一致性，是目前最快速的分子診斷方法，也成為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法的補(bǔ)充。Faye等［7］報(bào)道了在幾內(nèi)亞埃博拉疫情暴發(fā)期間，使用Qiagen公司SpeedXtract （SE）快速提取血清和拭子樣本中的病毒RNA，并使用RT-RPA方法對(duì)N基因進(jìn)行檢測(cè)，其特異性、靈敏性良好，可在8分鐘檢測(cè)到血漿樣品中15個(gè)拷貝數(shù)的RNA，在檢測(cè)臨床樣本中，與RT-qPCR方法的復(fù)合率為100%?？谔阋卟《緦?shí)時(shí)定量RTRPA檢測(cè)方法與RT-LAMP方法相比，引物設(shè)計(jì)上更為簡(jiǎn)單；較RT-PCR方法，節(jié)約了反應(yīng)時(shí)間，適于邊境口岸監(jiān)測(cè)及口蹄疫暴發(fā)地區(qū)的感染動(dòng)物篩查。目前，分別針對(duì)中東呼吸綜合征冠狀病毒、牛冠狀病毒、牛痘病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、西格瑪病毒、羊口瘡病毒等設(shè)計(jì)了特異引物和探針，建立了RPA方法，證實(shí)具有良好的特異性和敏感性（表1）。

3.2 細(xì)菌檢測(cè)

在細(xì)菌檢測(cè)方面，關(guān)于RPA最早報(bào)道是對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌的檢測(cè)研究。Lutz等［8］開(kāi)發(fā)了基于鉑片微流體技術(shù)的卡盒，檢出限為20個(gè)拷貝數(shù)DNA，反應(yīng)15分鐘即可得到結(jié)果。Ren等［9］針對(duì)布氏桿菌omp31基因片段設(shè)計(jì)了四條上游引物和四條下游引物，進(jìn)行組合并檢測(cè)其反應(yīng)時(shí)間和熒光強(qiáng)度，篩選出最佳引物組合。通過(guò)將RPA技術(shù)與固相芯片技術(shù)結(jié)合，開(kāi)發(fā)了淋病奈瑟氏菌、沙門(mén)氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的快速、多重檢測(cè)技術(shù)。針對(duì)新生兒B族鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體（MTC）、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、弗朗西斯土拉桿菌等開(kāi)發(fā)的RPA檢測(cè)方法較PCR技術(shù)明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間，具有臨床分子診斷應(yīng)用前景［10］。在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，特別是在污染細(xì)菌的牛奶檢測(cè)中，RPA酶和緩沖液混合，在39 ℃下，無(wú)需提取DNA，即可檢測(cè)牛奶樣品中的沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157：H7、副溶血性弧菌，整個(gè)檢測(cè)至結(jié)果讀取總耗時(shí)僅為30分鐘。

表1　RPA技術(shù)檢測(cè)病原的報(bào)道

3.3 寄生蟲(chóng)檢測(cè)

在寄生蟲(chóng)檢測(cè)方面，Crannell等［11］采用RPA檢測(cè)糞便樣品中賈第鞭毛蟲(chóng)，使用側(cè)流層析試紙條讀取結(jié)果，每毫升糞便樣品中最低可檢測(cè)到103～103.5個(gè)卵囊，敏感性是PCR方法的73%，特異性是顯微鏡檢查方法的95%，方法通過(guò)進(jìn)一步改進(jìn)有望用于“point-of-care”（POC，床旁檢測(cè)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)）。Crannell等［12］進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了基于RPA技術(shù)的多重側(cè)流層析試紙條，通過(guò)構(gòu)建不同的標(biāo)記探針，能夠同時(shí)檢測(cè)和鑒別引起腹瀉的原蟲(chóng)：賈第鞭毛蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)和阿米巴蟲(chóng)DNA，從糞便樣本提取活寄生蟲(chóng)DNA，檢測(cè)限分別為每個(gè)反應(yīng)444、6、9個(gè)寄生蟲(chóng)。目前還開(kāi)發(fā)尿路血吸蟲(chóng)、阿米巴變形蟲(chóng)、惡性瘧原蟲(chóng)側(cè)流層析試紙條，已證實(shí)具有良好的特異性和靈敏性，且使用便捷。

3.4 其他病原

針對(duì)山羊支原體、恙蟲(chóng)病立克次體、沙眼衣原體（O. tsutsugamushi或 R. typhi）分別開(kāi)發(fā)了熒光定量RPA方法和RPA側(cè)流層析試紙條，檢測(cè)靈敏度與熒光定量PCR方法相當(dāng)。Ahmed等［13］開(kāi)發(fā)實(shí)時(shí)定量RPA方法用于檢測(cè)血液臨床樣品中的鉤端螺旋體，并有望檢測(cè)水庫(kù)等環(huán)境中存在的病原。

4　展望

今后RPA檢測(cè)技術(shù)有望向多重、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方向發(fā)展。

4.1 多重

使用絕緣硅芯片制備64道光學(xué)環(huán)狀諧振器，與RPA技術(shù)聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)樣品的多重檢測(cè)。Crannell等［12］基于RPA技術(shù)的多重側(cè)流層析試紙條，通過(guò)構(gòu)建不同的標(biāo)記探針，能夠同時(shí)檢測(cè)和鑒別引起腹瀉的原蟲(chóng)：賈第鞭毛蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)和阿米巴蟲(chóng)。通過(guò)將RPA技術(shù)與固相芯片技術(shù)結(jié)合，開(kāi)發(fā)了多重檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)特定的固定化寡核苷酸產(chǎn)生空間分辨的信號(hào)，并對(duì)信號(hào)進(jìn)行讀取，實(shí)現(xiàn)在38℃下對(duì)淋病奈瑟氏菌、沙門(mén)氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的快速檢測(cè)［14］。

4.2 現(xiàn)場(chǎng)

由于實(shí)時(shí)定量RT-PCR儀通常體積較大、價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜，不適合現(xiàn)場(chǎng)篩查檢測(cè)分析。目前基于RPA技術(shù)和SlipChip（滑動(dòng)芯片），開(kāi)發(fā)透明丙烯酸樹(shù)脂裝置，用于檢測(cè)艱難梭菌毒素B基因，由于其易用性和低成本，可投放于醫(yī)療條件有限的地區(qū)應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷［1］。微流體數(shù)字化RPA滑動(dòng)芯片，可對(duì)單分子靶核酸進(jìn)行放大和計(jì)數(shù)，從RPA擴(kuò)增反應(yīng)起始前可淘汰假陽(yáng)性結(jié)果，采用終點(diǎn)熒光讀數(shù)進(jìn)行“是”或“否”的數(shù)字量化［15］。例如，2014年，當(dāng)幾內(nèi)亞暴發(fā)埃博拉疫情時(shí)，使用了移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)埃博拉病毒進(jìn)行診斷，其核心技術(shù)為RPA。移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室包括手套式操作箱和DiaS裝置（含用于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的ESEQuant TS2和集成觸摸屏），易于安裝和運(yùn)輸。通過(guò)使用DiaS裝置，進(jìn)行RT-RPA反應(yīng)，包括加樣和混勻時(shí)間，共需20分鐘即可讀取結(jié)果。移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)太陽(yáng)能電池可工作16小時(shí)［7］。

5　小結(jié)

相比傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)，RPA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于可實(shí)現(xiàn)感染早期的診斷，且敏感性高。與RPA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)類(lèi)似，迄今，由日本Eiken公司開(kāi)發(fā)的LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）技術(shù)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道已超過(guò)1 000篇。但相比RPA技術(shù)，LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)繁瑣、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、讀取結(jié)果主觀性強(qiáng)。RPA方法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，無(wú)需昂貴的設(shè)備及相關(guān)的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，在檢測(cè)的靈敏性和特異性上與熒光定量PCR相當(dāng)。該方法適用于一些難以根除的疾病，如艾滋病、瘧疾、肺結(jié)核以及烈性、新發(fā)傳染病病原，如埃博拉病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒、寨卡病毒的檢測(cè)，特別適用于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Research Progress of Recombinant Enzyme Polymerase Amplification （RPA）in Rapid Detection of Diseases

Fan Xiaoxu，Zhao Yonggang，Li Lin，Wu Xiaodong，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，External Disease Research Center，Qingdao，Shandong 266032）

Recombinase polymerase amplification （RPA） is a nucleic acid amplification technique developed in recent years. The test retains the highest levels of sensitivity and specificity，while adding extraordinary speed and portability. The assay generally amplified target DNA at room temperature in 10～20 minutes. It reduces the need of infrastructure and resources and is particularly suitable for rapid diagnosis in veterinary，food safety，biological defense，agriculture and other fields. The principle of RPA as well as the current application in the detection of viruses，bacteria，parasites and other pathogens were introduced，and the future use of testing in point of care and field settings were prospected.

recombinase polymerase amplification；rapid diagnosis；application

R730.43

A

1005-944X（2016）08-0072-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.021

潛在入侵的畜禽疫病口岸監(jiān)測(cè)技術(shù)研究（2016YFD0501104）

王志亮