賈麗君肖菊香西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，西安74西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，西安76

IDO-siRNA對胃癌細(xì)胞株MGC803中IDO與IL-6水平的影響

賈麗君1#肖菊香2
1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，西安7100042西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，西安7100610

目的本實驗以吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）為切入點，對比分析IDO-siRNA干擾前后胃癌細(xì)胞株MGC803中IDO及IL-6表達水平變化，研究IDO在胃癌及抑郁中發(fā)生、發(fā)展的作用，探討胃癌促發(fā)抑郁的可能分子機制。方法采用siRNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株MGC803，免疫細(xì)胞化學(xué)法及RT-PCR法觀察IDO蛋白及基因水平的變化，ELISA法檢測轉(zhuǎn)染siRNA前后胃癌細(xì)胞株上清液中IL-6表達水平，研究IDO對胃癌細(xì)胞株以及抑郁相關(guān)細(xì)胞因子的影響。結(jié)果胃癌細(xì)胞MGC803經(jīng)轉(zhuǎn)染IDO-siRNA后IDO的表達經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)及RTPCR法的檢測均明顯下降（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染IDO-siRNA 24 h后胃癌細(xì)胞MGC803的細(xì)胞上清液中IL-6的表達較未轉(zhuǎn)染前明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論IDO在胃癌細(xì)胞株MGC803中高表達；IDO-siRNA可抑制胃癌細(xì)胞株MGC803中IDO的表達；胃癌細(xì)胞株MGC803經(jīng)IDO-siRNA干擾后分泌的細(xì)胞因子IL-6的表達減弱，表明IDO與IL-6的表達存在關(guān)聯(lián)，IL-6可能在胃癌及抑郁的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。

胃癌；IDO；IL-6；siRNA

Oncol Prog，2016，14（5）

胃癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第五位和第三位，具有發(fā)病率高、發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和病死率高等特點［1］。胃癌的發(fā)病因素有很多，隨著醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變，社會心理因素在癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用越來越受到關(guān)注。近年來，針對惡性腫瘤患者心理健康狀況的研究表明患者情緒障礙發(fā)生率很高，其中以抑郁最為常見。抑郁作為惡性腫瘤患者最常見的心理障礙之一，直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，降低患者的生活質(zhì)量［2］。因惡性腫瘤與抑郁之間互相影響，故對腫瘤和抑郁以及二者之間相互關(guān)系的研究就具有重要的臨床意義。

吲哚胺2，3雙加氧酶（Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO），是肝臟以外唯一可催化色氨酸分解代謝的限速酶，色氨酸是細(xì)胞維持活化和增殖所必需的氨基酸，也是神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的前體［3］。研究發(fā)現(xiàn)胃癌中有IDO的高表達，而IDO與抑郁的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］，還與腫瘤免疫抑制及腫瘤耐藥等相關(guān)。白細(xì)胞介素-6（in-terleukin-6，IL-6）是一種多功能的細(xì)胞因子，可在多種腫瘤組織和細(xì)胞中表達，影響腫瘤的增殖和分化，還可影響神經(jīng)內(nèi)分泌功能及5-HT的代謝，從而與抑郁密切相關(guān)［5］。IDO與IL-6也可相互作用。IL-6可通過干擾素非依賴途徑參與IDO表達調(diào)控，IDO又可通過分解色氨酸在一定程度上增強IL-6的作用［6］。因此研究二者在胃癌細(xì)胞株中的表達，并探討兩者之間的相互關(guān)系對闡明胃癌及腫瘤相關(guān)性抑郁發(fā)生的機制具有重要意義。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人胃癌細(xì)胞系MGC803來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；小牛血清購自杭州四季青公司；胰蛋白酶購自Solarbio公司；兔抗人IDO多克隆抗體購自英國ABCAM公司；SP免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；siRNA合成由廣州銳博生物科技有限公司提供；PCR引物合成，RNAiso Plus，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa Ex Taq試劑盒及DNA marker均購自大連寶生物工程有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞系MGC803由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所保存，在含10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素雙抗的RPMI 1640中，于37℃，飽和濕度及5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.3免疫組織化學(xué)染色

取對數(shù)生長期MGC803細(xì)胞以1.0×105/ml密度接種于蓋玻片上，0.3%TritonX-100作用增加胞膜通透性，3%過氧化氫去離子水孵育阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性，10%山羊血清（PBS稀釋）閉阻斷非特異性抗原，加一抗4℃過夜，加羊抗兔二抗工作液孵育，加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液孵育后PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡下觀察，先在低倍鏡（×100）下確定目標(biāo)，每張切片隨機選擇5個高倍鏡視野（×400），應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行定量灰度掃描后進行分析。

1.4 IDO-siRNA轉(zhuǎn)染MGC803胃癌細(xì)胞

取對數(shù)生長期細(xì)胞為實驗對象，分4組：空白對照組（未轉(zhuǎn)染）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組）、陽性對照組（β-actin-siRNA）及IDO-siRNA轉(zhuǎn)染組。詳細(xì)序列如下：

IDO-siRNA β-actin-siRNA陰性對照正義鏈5'GAACGGGACACUUUGCUAAdTdT3'反義鏈3'dTdT CUUGCCCUGUGAAACGAUU5' ssD1021 ssD1022（購買siRNA質(zhì)粒代碼）siNO5815122147

轉(zhuǎn)染前1天將胃癌細(xì)胞接種到六孔板，siRNA作用后分別于24 h及48 h檢測基因表達，48 h檢測蛋白表達。

1.5 RT-PCR檢測各組細(xì)胞IDO mRNA表達

轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，Trizol試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟，獲取檢測各實驗組cDNA并進行PCR擴增。引物序列如下：

IDOβ-actin上游：5'GCTTGCAGGAATCAGGATGT3'下游：5'GGCAAAGGTCATGGAGATGT3'上游：5'ATCGTG CGTGACATTAAGGAGAAG3'下游：3'AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG5'

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，59.7℃退火20 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像儀分析，以IDO/β-actin條帶灰度值的比值代表其mRNA的相對表達量。

1.6 IL-6表達水平的檢測

分別提取胃癌細(xì)胞MGC803、轉(zhuǎn)染IDO-siRNA或陰性對照24 h后細(xì)胞的細(xì)胞上清，在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后分別加入未轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清、轉(zhuǎn)染IDO-siRNA 24 h后細(xì)胞上清及轉(zhuǎn)染陰性對照24 h后細(xì)胞上清各再10 μl，用封板膜封板后置37℃溫育30 min，加洗滌液洗滌5次后每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，繼續(xù)溫育及洗滌各1次，顯色，終止，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD）值。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理。由于數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，各組間計量資料比較用非參數(shù)秩和檢驗，Mann-Whitney U檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 IDO-siRNA干擾前后人胃癌細(xì)胞系MGC803細(xì)胞中IDO表達比較

人胃癌細(xì)胞系MGC803細(xì)胞中IDO表達陽性，主要表達于細(xì)胞質(zhì)中，呈淡黃色至棕褐色顆粒狀；胃癌細(xì)胞MGC803經(jīng)IDO-siRNA干擾后，胞質(zhì)呈淡藍色，到黃色或棕褐色顆粒狀沉淀少見，IDO蛋白的表達明顯減弱。（圖1）

圖1　IDO-siRNAsiRNA干擾前后人胃癌細(xì)胞系MGCMGC803803細(xì)胞中IDOIDO蛋白表達（×400400）

2.2 RT-PCR結(jié)果

RT-PCR分析表明人胃癌細(xì)胞株MGC803中IDO基因在mRNA水平呈高表達。MGC803胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染IDO-siRNA后，于24 h進行檢測，結(jié)果顯示IDO mRNA表達量明顯低于空白對照組、陽性對照組及陰性對照組（P＜0.05）；而空白對照組、陽性對照組及陰性對照組間兩兩比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖2，表1）。

圖2　轉(zhuǎn)染后MGCMGC803803細(xì)胞β -actinactin和IDOIDO的表達

表1　 IDOIDO-siRNAsiRNA干擾前后MGCMGC803803細(xì)胞IDOIDO mRNAmRNA的表達

2.3 IL-6水平的變化

分別測胃癌細(xì)胞MGC803、轉(zhuǎn)染IDO-siRNA 24 h后細(xì)胞上清中IL-6的表達。IDO-siRNA組細(xì)胞上清IL-6濃度為（1.366±0.036），低于空白對照組的（1.931±0.038），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討論

胃癌的發(fā)生是外源性因素和機體內(nèi)在因素等多種因素綜合作用的結(jié)果。社會心理因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關(guān)注［7］，因癌癥的轉(zhuǎn)移易復(fù)發(fā)及死亡率高等特殊性，患者往往有較重的心理負(fù)擔(dān)，加上癌癥所帶來的疼痛，手術(shù)導(dǎo)致的形體及功能的改變，化療過程中的惡心嘔吐等不良反應(yīng)，病程長經(jīng)濟負(fù)擔(dān)重等原因，癌癥抑郁的發(fā)生率很高。而抑郁亦對腫瘤產(chǎn)生影響，抑郁障礙啟動神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)環(huán)路，使機體免疫功能下降，影響癌癥的發(fā)生發(fā)展［8］。因抑郁與癌癥之間互相影響，故探討胃癌引發(fā)抑郁及抑郁促進胃癌發(fā)生發(fā)展可能的分子機制，可為改善胃癌患者的抑郁狀況及預(yù)后提供臨床思路。

近年來，很多研究表明IDO與單胺能遞質(zhì)、細(xì)胞因子及神經(jīng)元可塑性密切相關(guān)，在抑郁癥的發(fā)病及治療中具有重要作用。研究顯示IDO水平與抑郁樣癥狀呈正相關(guān)，且其基線水平與6年后追蹤調(diào)查中人群的抑郁樣癥狀呈正相關(guān)［9］。動物研究表明中樞或外周給予脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）導(dǎo)致小鼠體內(nèi)IDO活性增強，出現(xiàn)抑郁樣行為，而提前給予IDO競爭性抑制劑可抑制IDO的活性，抑制小鼠抑郁樣行為的出現(xiàn)［10］。IDO的活性表達導(dǎo)致細(xì)胞色氨酸的耗竭及其分解代謝過程中產(chǎn)生的多種物質(zhì)，已有大量研究表明IDO在腫瘤組織中有高表達，提示IDO與多種惡性腫瘤的免疫逃逸、腫瘤耐藥及預(yù)后密切相關(guān)，尤其在惡性腫瘤相關(guān)性抑郁中起重要作用［11］，是腫瘤的不良預(yù)后指標(biāo)之一，而RNA干擾技術(shù)可直接對IDO的表達進行抑制［12］，從而有可能成為一個新的治療方法來控制腫瘤發(fā)展和改善腫瘤抑郁患者的生活質(zhì)量。

本組研究首先從細(xì)胞水平出發(fā)，證明了IDO在胃癌細(xì)胞株MGC803中表達。其次成功轉(zhuǎn)染IDO-siRNA至胃癌MGC803細(xì)胞，應(yīng)用免疫組化及RTPCR法證實胃癌MGC803細(xì)胞中的IDO被成功沉默，酶聯(lián)免疫檢測證實了IDO-siRNA能顯著減少胃癌細(xì)胞中IL-6的表達。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，主要通過自分泌和旁分泌的方式產(chǎn)生［13］。大量研究表明，IL-6能促進腫瘤的生長，并對其擴散和轉(zhuǎn)移也有一定作用。隨著抑郁癥細(xì)胞因子學(xué)說的提出，IL-6在抑郁發(fā)生發(fā)展中的作用也越來越被關(guān)注。IL-6可通過影響神經(jīng)內(nèi)分泌功能、與氧化應(yīng)激共同作用引起抑郁［14］，但其確切機制仍有待進一步研究。IDO可通過降解色氨酸抑制一些蛋白的合成從而抑制IL-6的表達，從而緩解抑郁癥狀［15］。本組研究檢測了干擾前后胃癌細(xì)胞上清中細(xì)胞因子IL-6的水平，結(jié)果顯示經(jīng)IDO-siRNA干擾后胃癌細(xì)胞上清中IL-6明顯降低（P＜0.01）。因此，IDO能有效減少胃癌細(xì)胞中IL-6的表達，從而延緩腫瘤進展，并減少抑郁癥的發(fā)生。當(dāng)然也有研究顯示，IL-6能通過干擾素非依賴途徑激活I(lǐng)DO，但是本研究并未進行相關(guān)實驗證實。

綜上所述，IDO在胃癌細(xì)胞株MGC803中有表達，用IDO-siRNA轉(zhuǎn)染后，IDO的表達可明顯減弱，且干擾后胃癌細(xì)胞株分泌的細(xì)胞因子IL-6的表達也降低。因此IDO作為腫瘤與抑郁發(fā)生發(fā)展的橋梁，可為探索胃癌的潛在治療靶點及防治腫瘤相關(guān)性抑郁提供理論依據(jù)。

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The effectt of IDO-siRNA on indoleamine 2.3-dioxygenase and interleukiinn-- 66 iinn gastric cancer cell line MGC803

JIALi-jun1#XIAO Ju-xiang2
1Department of Oncology，Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China2Department of Oncology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

ObjectivectiveTo observe the expression levels of indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO）and the secretion of interleukin-6（IL-6）in gastric cancer cell line MGC803 before and after the application of IDO-siRNA，to investigate the effect of IDO in the development of gastric cancer and cancer related depression.MethodethodGastric cancer cell line MGC803 was transfected with siRNA，the expression changes of IDO-siRNA and IDO protein were determined by RTPCR and immunocytochemistry.The change of IL-6 secretion was measured by ELISA.The effect of IDO on cancer cell line and depression related cytokines was investigated.ResultesultAfter application of IDO-siRNA，the expression of IDO and the secretion of IL-6 in the gastric cancer cell line MGC803 was decreased significantly（P＜0.01）.ConclusionusionIDO is highly expressed in gastric cancer cell line MGC803；IDO-siRNA can inhibit the expression of IDO in gastric cancer cell line MGC803：after application of IDO-siRNA，the secretion of IL-6 was decreased significantly in gastric cancer cell line MGC803，indicating that IDO expression and IL-6 was positively correlated，and IL-6 might be engaged in the development of gastric cancer and related depression.

rdsgastric cancer；indoleamine 2，3-dioxygenase；interleukin-6；siRNA

R735. 2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.05.19

（corresponding author），郵箱：jialijun112@163.com

2015-12-08）