劉順航,徐詠全,李長文,何忠榮,王 超

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不同年份生產(chǎn)帝泊洱茶珍HPLC指紋圖譜研究

劉順航,徐詠全,李長文,何忠榮,王 超*

(云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司,云南 普洱 665000)

本研究對2011～2014年生產(chǎn)的20個帝泊洱茶珍樣品進行分析,建立了帝泊洱茶珍高效液相色譜指紋圖譜,同時結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對帝泊洱茶珍和競品茶珍進行區(qū)分.結(jié)果表明:指紋圖譜相似性分析,帝泊洱茶珍相似系數(shù)均大于0.995,而10個競品茶珍相似度均小于0.970.通過系統(tǒng)聚類和偏最小二乘判別分析,可明顯區(qū)分帝泊洱茶珍和競品茶珍.變量投影重要性準則研究顯示,沒食子酸(GA)、3號峰(未知物)、沒食子兒茶素(GC)、兒茶素(C)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)等5種化合物相對含量的不同是區(qū)分帝泊洱茶珍與競品茶珍主要因素.

帝泊洱茶珍;高效液相色譜;指紋圖譜;化學(xué)計量學(xué)

普洱茶是一種獨特的后發(fā)酵茶,主要產(chǎn)自中國云南省,它的制作和運輸銷售已有上千年的歷史[1].近年來,由于其抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血糖、減肥等功效[2],以及其獨特的口感,越來越受到國內(nèi)外消費者的青睞.普洱茶珍,是一種為迎合大眾健康快節(jié)奏生活方式應(yīng)運而生的經(jīng)浸提、濃縮、噴粉和冷凍干燥制成的普洱茶速溶茶.

茶一直以感官審評作為其品質(zhì)評價的主要方式,但由于評價環(huán)境、審評設(shè)備、審評人員工作經(jīng)驗、審評人員身體狀況等不穩(wěn)定因素的影響,不可避免地導(dǎo)致審評結(jié)果有時會出現(xiàn)較大的個體偏差.因此,尋找科學(xué)、全面、可量化的茶品質(zhì)評價和質(zhì)量監(jiān)控方法,已成為茶領(lǐng)域研究的重點和熱點.

1976年,Hoefler等人首次應(yīng)用中藥指紋圖譜技術(shù)研究了茶葉組成成分,為茶葉高效液相色譜分析方法首開先例[3].近年,針對普洱茶指紋圖譜的研究已有相關(guān)報道.寧井銘等[4-6]針對普洱曬青毛茶和普洱生茶指紋圖譜作了大量工作,從指紋圖譜的整體性出發(fā),利用相關(guān)系數(shù),夾角余弦、重疊率、系統(tǒng)聚類和主成分分析等識別模式,對普洱茶曬青毛茶和綠茶、不同等級普洱生茶進行了分析和區(qū)分.李揚等[7]發(fā)現(xiàn)景邁茶區(qū)不同曬青毛茶樣品的指紋圖譜具有極高的相似度,但景邁茶區(qū)曬青毛茶的標準圖譜與其他地區(qū)茶樣間的相似度差異較大.張梁等[8]又進行了不同產(chǎn)地普洱生茶和普洱熟茶指紋圖譜的建立,為兩者的質(zhì)量評價提供了依據(jù).

本研究采用高效液相(HPLC)建立不同年份帝泊洱茶珍指紋圖譜,并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對帝泊洱茶珍和競品進行區(qū)分,旨在為帝泊洱茶珍質(zhì)量控制和競品判別提供可量化的手段.

1　材料與方法

1.1材料與儀器

20個批次帝泊洱普洱茶珍(表1),云南帝泊洱生物茶集團有限公司;10個競品茶珍(表1),購于普洱市場;乙腈(色譜純)(美國TEDIA公司);磷酸(色譜純)(Aladdin,中國,上海).Waters e2695-2489高效液相色譜儀(美國waters公司);電子分析天平(梅特勒公司); Mill-Q超純水凈化系統(tǒng)(美國 Millipore公司).

表1　普洱茶珍樣品信息Table 1 The information on the samples of Pu-erh tea extract

1.2實驗方法

1.2.1供試液的制備

稱取茶珍樣品0.1500±0.0002 g,至50 mL燒杯中,加入30 mL超純水,30℃水浴超聲5 min,使茶粉充分溶解.超聲后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,加水定容至刻度,過0.45 μm尼龍濾膜后備用.

1.2.2色譜條件

色譜柱:Synergi 4u Hydro-RP 80AC18柱(250 mm X 4.6 mm ID, 美國菲羅門公司);流動相A:乙腈(含0.05%磷酸),流動相B:水(含0.05%磷酸);進樣量10 μL;柱溫30 oC;檢測波長210 nm;流速為1.0 mL.min-1;梯度洗脫程序為0～50 min,2% A、98% B → 25% A、75% B; 50～55 min,25% A、75% B→2% A、98% B;進下一樣品之前2% A、98% B平衡色譜柱15 min.

1.2.3數(shù)據(jù)處理

采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件(中國,北京)分析茶珍HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù),確定共有峰,生成對照指紋圖譜并進行相似度計算.采用IBM SPSS Statistics 20進行系統(tǒng)聚類(HCA).SIMCA-P+12.0進行帝泊洱茶珍和競品茶珍差異計算.

2　結(jié)果與分析

2.1指紋圖譜的構(gòu)建和解析

2.1.1共有峰的標記

對20批茶珍進行指紋圖譜分析,以咖啡因作為參考峰,標定了13個共有峰,分別為1號(11.621 min)、2號(13.209 min)、3號(14.304 min)、4號(17.762 min)、5號(18.403 min)、6號(25.006 min)、7號(27.243 min)、8號(29.120 min)、9號(32.608 min)、10號(34.546 min)、11號(37.199 min)、12號(43.428 min)和13號(44.882 min),其中8號峰為咖啡因(圖1).

2.1.2 相似度計算

將20批帝泊洱茶珍的指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件,經(jīng)多點校正,色譜峰匹配及生成對照圖譜,以中位數(shù)生成茶珍對照指紋圖譜,將該對照指紋圖譜的相似度定為1,計算得出20批次茶珍的相似度均在0.996～0.999(表2),表明茶珍在長期的存放過程中,化學(xué)成分和其含量變化較小,茶珍產(chǎn)品穩(wěn)定性較高(圖2).以20批帝泊洱茶珍的對照指紋圖譜為參照,計算得出10個競品茶珍的相似度在0.938～0.963 (表2).表明了競品茶珍與帝泊洱茶珍之間存在差別.

圖1　20批茶珍對照色譜圖(8號為咖啡因)Fig. 1 The chromatomap of 20 tea extract samples (No.8 caffeine)

表2　帝泊洱茶珍和競品茶珍相似度Table 2 The similarity of 20 tea extract samples between Deepure and Pu-erh tea

圖2　20批茶珍HPLC色譜圖Fig. 2 The HPLC chromatomap of 20 Pu-erh tea extract

2.2帝泊洱茶珍與競品茶珍系統(tǒng)聚類分析

應(yīng)用SPSS軟件對帝泊洱的20批茶珍和10個競品茶珍中13個共有峰的相對峰面積進行系統(tǒng)聚類分析.從圖3中可以看到聚類的趨勢, 30個茶珍樣品系統(tǒng)聚類的結(jié)果可分為兩大類(線II):帝泊洱茶珍聚為一大類,競品茶珍聚為一大類.在帝泊洱茶珍樣品中,閾值最低層(線I)被劃分一類的樣品來自同一年份,能夠較好的聚集在一起成為一類.10個競品茶珍與帝泊洱茶珍差異性較大,聚為一大類;同時從競品茶珍聚類看,10個廠家的茶珍之間也能很好的聚為小類.

圖3　30個茶珍樣品系統(tǒng)聚類分析圖Fig. 3 The Systematic Assembling Analytical Map of 30 pu-erh tea extract samples

2.3帝泊洱茶珍與競品茶珍差異分析

以30個茶珍樣品中13個共有峰的相對峰面積為變量進行偏最小二乘判別分析,建立PLS-DA模型(圖4)研究帝泊洱茶珍與競品茶珍的差異.結(jié)果顯示,帝泊洱茶珍與競品茶珍呈現(xiàn)明顯的分離趨勢,帝泊洱不同年份茶珍聚集同樣出現(xiàn)分離趨勢,說明茶珍在長期存放過程中基礎(chǔ)物質(zhì)仍有細微的變化.為了進一步探究引起茶珍之間差異的重要化學(xué)信息,按照PLS-DA結(jié)果對30批茶珍指紋圖譜中13個共有色譜峰VIP值大小進行排序,其中5個色譜峰(峰2-GA、峰3-unknow、峰5-GC、峰7-C和峰10-EGCG)VIP值>1(圖5),這5種化合物含量的不同是區(qū)分帝泊洱茶珍與競品茶珍的主要因素.

圖4　30個茶珍樣品PLS-DA分析得分散點圖Fig. 4　The distribution point map of 30 pu-erh tea extract samples

圖5　變量投影重要性準則圖Fig. 5 The Variable projection importance criterion

3　結(jié)論

系統(tǒng)聚類、偏最小二乘分析和變量投影重要性準則作為化學(xué)計量學(xué)方法,能夠找到隱藏在眾多共性下的差異.本文利用指紋圖譜技術(shù)建立了不同年份帝泊洱茶珍HPLC指紋圖譜,共標記了13個共有峰,帝泊洱不同年份的20個批次茶珍相似度均≥0.996;以帝泊洱20批次茶珍對照指紋圖譜為參照,10個競品茶珍的相似度均≤0.963.以13個共有峰的相對峰面積為變量,對帝泊洱20批茶珍和10個競品茶珍進行化學(xué)計量學(xué)分析,聚類分析結(jié)果顯示系統(tǒng)聚類可對帝泊洱茶競品茶珍進行區(qū)分;進一步進行偏最小二乘判別分析,結(jié)果與聚類分析相似,變量投影重要性準則分析顯示,5個化合物(峰2-GA,峰3-unknow,峰5-GC,峰7-C和峰10-EGCG)相對含量的差別是區(qū)分帝泊洱茶珍與競品茶珍的重要因素.

本實驗建立的HPLC指紋圖譜分析方法,能夠使帝泊洱茶珍共有成分在色譜中體現(xiàn),所建立的指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性與可控性,可進一步用于帝泊洱茶珍質(zhì)量的控制,同時可作為帝泊洱茶珍與競品茶珍區(qū)分的一種手段.

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[3] Hoefler A. C, Coggon P. Reversed-phase high-performance liquid chromatography of tea constituents [J]. Journal of Chromatography A, 1976 (129)∶ 460-463.

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[6] 寧井銘, 顏玲,宛曉春,等. 基于HPLC技術(shù)的普洱生茶指紋圖譜研究 [J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(2)∶200-206.

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Study on Deepure Instant Pu-erh Tea from Different years by HPLC Fingerprint

LIU Shun-hang,XU Yong-quan,LI Chang-wen,HE Zhong-rong,WANG Chao*
(Yunnan Tasly Deepure Biological Tea Group Co., Ltd, Pu'er 665000, China)

In this study, 20 batches Deepure instant pu-erh tea samples from 2011-2014 were evaluated by using high liquid chromatography (HPLC) fingerprint. Meanwhile, the Deepure instant pu-erh tea samples were authenticated within different manufacturers by chemometrics method. The chemometrics method included hierarchical clustering analysis, partial least squares-discriminant analysis and variable importance for the project analysis. Results showed that the similarities of 20 batches of instant pu-erh tea samples were more than 0.995, and the 10 similar products were lower than 0.970. The Deepure instant pu-erh tea samples and similar products can be significantly distinguished by hierarchical clustering analysis, partial least squares-discriminant analysis. The results of variable importance for the study showed that five compounds were the important factors for discrimination of samples.

Deepure instant pu-erh tea, High liquid chromatography, Fingerprint, Chemometrics method

O657.72,TS272.7

A

1009-525X(2016)02-24-29

2016-04-29

2016-05-30

劉順航(1976-),男,福建仙游人,高級工程師,主要從事普洱茶提取和安全控制方面的研究.

王超,wangchao2809@126.com