孫　建，蔡為榮，謝亮亮，許惠玲，孫濤濤，田　正（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖　241000）

生物與食品科學(xué)

荷葉多酚體外抗氧化活性研究

孫建，蔡為榮?，謝亮亮，許惠玲，孫濤濤，田正
（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

探究荷葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性.以體積分?jǐn)?shù)55%乙醇恒溫浸提荷葉中的多酚類(lèi)物質(zhì)，得到粗多酚（LP-C），經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化得純化多酚（LP-P），LP-C經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附依次由30%乙醇和50%乙醇洗脫，得級(jí)分LP-30和LP-50；對(duì)上述4組樣品的總還原力、羥基自由基清除率和亞硝酸鹽清除率進(jìn)行測(cè)定，采用HPLC-DAD法初步分析LP-30和LP-50成分.各組樣品在質(zhì)量濃度0.02～0.2 mg/m L范圍內(nèi)總還原力、清除羥基自由基活力和清除亞硝酸鹽活力有良好的量效關(guān)系；經(jīng)HPLC-DAD分離，級(jí)分LP-30出現(xiàn)3個(gè)主峰，LP-50出現(xiàn)7個(gè)主峰.荷葉多酚具有優(yōu)良的抗氧化活性.

荷葉；多酚；清除率；抗氧化活性；HPLC-DAD

荷葉（Nelumbinis Folium），又稱(chēng)蓮莖，古稱(chēng)芙蓉、菡萏、芙蕖，在我國(guó)南北均有分布，有上千年的食用歷史，它是睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）的干燥葉.荷葉苦平，歸肝、脾、胃，具有清解暑熱、涼血止血作用，同時(shí)具有抑制高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化、抗有絲分裂、抑菌和止痙攣等作用［1］.1991年衛(wèi)生部將荷葉列入第二批“既是食品又是藥品”的名單中［2］.同時(shí)，荷葉中的生物活性成分種類(lèi)繁多、含量豐富，這種源于自然、安全無(wú)害的植物越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)、食品、日用化工等行業(yè)的青睞.

現(xiàn)代研究表明，荷葉中除含有豐富的碳水化合物、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、單寧等常規(guī)化學(xué)成分外，還含有具有明顯生物活性和生理功能的黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、木脂素類(lèi)等多酚類(lèi)物質(zhì).Lee［3］等研究指出荷葉多酚物質(zhì)具有抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)血管再生的活性，同時(shí)荷葉中多酚類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的總還原力、清除DPPH·自由基活力和清除亞硝酸鹽活性.實(shí)際上，關(guān)于荷葉多酚的抗氧化活性、多酚中有效活性成分分析等報(bào)道并不多見(jiàn).研究立足于此，期望通過(guò)建立不同抗氧化體系探究荷葉多酚體外抗氧化活性強(qiáng)弱，繼而通過(guò)HPLC技術(shù)分離分析其活性成分.

1　材料與方法

1.1材料與試劑

荷葉，購(gòu)于蕪湖市中山藥房，干燥、粉碎后過(guò)80目篩備用；AB-8大孔樹(shù)脂（天津市南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng)產(chǎn)品）；Folin-Ciocalteu試劑（Sigma公司）；無(wú)水碳酸鈉、沒(méi)食子酸、抗壞血酸、乙酸、水楊酸、無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸均為分析純；無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸萘已二胺（AR，上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?；無(wú)水甲醇（色譜級(jí)），實(shí)驗(yàn)中試劑配制為雙蒸水，HPLC分析用超純水.

1.2儀器與設(shè)備

722型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；H H-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；LGJ-10冷凍干燥器（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；DHG-9023電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；JY1002電子天平（上海良平天平廠(chǎng)）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海青浦滬西儀器廠(chǎng)）；TGL-16C離心機(jī)（金壇市杰瑞爾）；DZX-6050B真空泵（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Waters1525高效液相色譜儀（配備1525二元泵，DAD2998檢測(cè)器，2707自動(dòng)進(jìn)樣器，Breeze2工作站；美國(guó)Waters公司）.

1.3方法

（1）沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制.參考Maria［4］等方法，并做少許改動(dòng).準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25 g沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品用50%乙醇溶液定容至50 m L容量瓶，再分別配制0.05 mg/m L、0.1 mg/m L、0.15 mg/m L、0.2 mg/m L、0.25 mg/m L、0.3 mg/m L、0.5 mg/m L標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別從上述標(biāo)液中各取0.1 m L于10 m L刻度試管中，加適量蒸餾水混合后，加入0.5 m L稀釋10倍的Folin-ciocalteu試劑，混合反應(yīng)5 min后加入2 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的Na2CO3溶液，混合，定容，靜置2 h后在765 nm處測(cè)吸光度.

（2）荷葉多酚的提取和含量測(cè)定.按料液比1∶20、溫度60℃、55%乙醇（V/V）條件下恒溫浸提90 min，將所得浸出物抽濾，濾渣按同樣條件再次浸提，抽濾，濾液混合.混合液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，38℃條件下真空除去乙醇，得到濃縮液，3 500 r/min下離心除去沉淀，得荷葉多酚粗提取液（LP-C）.適當(dāng)稀釋后計(jì)算待測(cè)液多酚質(zhì)量濃度C，按下式計(jì)算荷葉多酚提取率，以沒(méi)食子酸當(dāng)量（Gallic Acid Equivalent，GAE）表示，單位為mg GAE/g荷葉干粉.荷葉干粉提取率為：

式中，C為待測(cè)樣品液質(zhì)量濃度；V為提取液體積；N為濃縮液稀釋倍數(shù)；m為稱(chēng)量的荷葉粉質(zhì)量.

（3）粗多酚的純化.參考朱靜對(duì)大孔樹(shù)脂的處理方法［5］對(duì)AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理.將所得LP-C分為兩份，分別上柱，一份直接用70%（V/V）乙醇溶液進(jìn)行洗脫，得到樣品LP-P；另一份依次用30%（V/V）、50%（V/V）和70%（V/V）乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，得到級(jí)分LP-30、LP-50和LP-70.將所得洗脫液旋蒸除去溶劑，冷凍干燥.多酚純度計(jì)算：稱(chēng)取凍干后質(zhì)量為m2的樣品，溶解，測(cè)定其多酚總量m1，計(jì)算其純度為：

（4）抗氧化活性研究.準(zhǔn)確稱(chēng)取各組樣品（或Vc）50 mg溶解于50%乙醇中，轉(zhuǎn)移至50 m L容量瓶，定容得到質(zhì)量濃度1 mg/m L樣品原液.隨后配制各種不同質(zhì)量濃度樣品待測(cè)液，以Vc為陽(yáng)性對(duì)照，考察各組多酚樣品的總還原力，清除羥基自由基活力和清除亞硝酸鹽活力.

①總還原力的測(cè)定.參考Liu［6］等的方法，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水，鐵氰化鉀溶液須現(xiàn)配現(xiàn)用.②清除羥基自由基的測(cè)定.參考顏軍［7］等的方法，其清除率公式為：

式中，A0為空白對(duì)照液吸光值；A1為加入樣品后反應(yīng)體系吸光值；A2為樣品的本底吸光值.

③清除亞硝酸鹽的測(cè)定.參考宋茹［8］等的方法，其清除率公式為：

式中，A0為以樣品溶劑代替樣品溶液測(cè)得的吸光值；A1為加入樣品液后實(shí)驗(yàn)組吸光值；A2為以蒸餾水代替亞硝酸鈉溶液測(cè)得吸光值，樣品的本底吸收.

（5）HPLC-DAD分析.色譜分析主要考察了LP-30部分和LP-50部分可能含有的活性成分.DAD檢測(cè)器啟用3D波長(zhǎng)掃描模式，波長(zhǎng)掃描范圍210～400 nm.柱子為沃特斯Sunfire反相C18柱（4.6×150 mm，5μm），配備柱溫箱保持分離條件下恒溫30℃.進(jìn)樣體積為20μL，流速0.8 m L/min.流動(dòng)相：A相，無(wú)水甲醇；B相，0.5%乙酸水溶液（v/v）.LP-30部分與LP-50部分的活性成分種類(lèi)、性質(zhì)不同，故采用兩種不同梯度洗脫程序.對(duì)級(jí)分LP-30：0～10 min，5%～10%A相；10～30 min，10%～50%A相.對(duì)級(jí)分LP-50：0～8 min，30%～30%A相；8～18 min，30%～55%A相；18～40 min，55%～65%A相.

2　結(jié)果與分析

2.1各組樣品多酚的含量

應(yīng)用軟件Origin 8.0進(jìn)行線(xiàn)性擬合，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程Y=0.889 7X+0.009 3，在0.05～0.5 mg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.997 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示.

將多酚粗提液稀釋4倍，計(jì)算荷葉多酚提取率為48.50 mg GAE/g荷葉干粉，這與趙曉云［9］等對(duì)荷葉多酚的提取率相當(dāng).粗多酚（LP-C）經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后得到純化多酚（LP-P），其純度由24.24%提高到52.85%，顯示出大孔樹(shù)脂對(duì)荷葉粗多酚優(yōu)良的純化效果，這與李均［10］等對(duì)中華補(bǔ)血草根多酚的純化效果相當(dāng).另一部分粗多酚上大孔樹(shù)脂經(jīng)不同質(zhì)量濃度乙醇溶液梯度洗脫后，級(jí)分LP-30得率為總吸附量的59.63%，級(jí)分LP-50得率為總吸附量的21.2%，級(jí)分LP-70得率為總吸附量的4.87%.表明級(jí)分LP-30多酚含量最豐富，LP-50含量次之，LP-70含量最低.經(jīng)計(jì)算，荷葉多酚在大孔樹(shù)脂上總解吸率為86.35%.

2.2抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）各組樣品的總還原力大小.還原力強(qiáng)的樣品產(chǎn)生的電子能將反應(yīng)體系中的鐵氰化鉀（K3［Fe（CN）6］）的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵（亞鐵氰化鉀），二價(jià)鐵進(jìn)一步和三氯化鐵反應(yīng)，生成在700 nm波長(zhǎng)下有最大吸光值的普魯士藍(lán)（Fe4［Fe（CN）6］3）［11］.依照同樣的反應(yīng)機(jī)理，孟慶煥［12］測(cè)定了牡丹種皮黃酮的總還原力，反應(yīng)體系吸光值越大表示樣品的還原力越強(qiáng)，還原力與樣品抗氧化能力呈正相關(guān).不同質(zhì)量濃度下4組樣品和Vc在700 nm波長(zhǎng)處的吸光值變化如圖2所示.由圖2可以看出，各組樣品隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，A700吸光值不斷增大，還原力不斷增強(qiáng).整體來(lái)看，Vc的總還原力最強(qiáng)，在0.08 mg/m L質(zhì)量濃度時(shí)，吸光值達(dá)到0.533，而LP-P為0.331，LP-C僅為0.12，總還原力大小順序?yàn)椋篖P-P＞LP-30＞LP-50＞LP-C.在質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/m L時(shí)，LP-P與LP-C在700 nm處吸光度分別為0.461與0.159.可見(jiàn)，荷葉多酚經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化后，總還原力有顯著增強(qiáng).級(jí)分LP-30總還原力比LP-50強(qiáng)，質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/m L時(shí)，兩者的吸光值達(dá)到0.61和0.342，這可能與兩樣品中多酚的含量、種類(lèi)和性質(zhì)有關(guān).

圖1　沒(méi)食子酸測(cè)定總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖2　不同質(zhì)量濃度Vc和4組樣品在700 nm波長(zhǎng)處吸光值

（2）各組樣品對(duì)羥基自由基的清除能力.生物體內(nèi)，有害的羥基自由基會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)氧化并與生物大分子反應(yīng)，造成細(xì)胞損傷乃至死亡［13］.樣品和Vc在不同質(zhì)量濃度下對(duì)羥基自由基的清除率如圖3所示.由圖3可以看出，Vc對(duì)羥基自由基的清除率最高，質(zhì)量濃度為0.04 mg/m L時(shí)，清除率即達(dá)到50.15%，而LP-C在質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/m L時(shí)，清除率僅有47.44%，但級(jí)分LP-30與LP-50清除率分別達(dá)到71.12%和63.73%.經(jīng)計(jì)算，LP-30和LP-50的IC50分別為0.059 3 mg/m L和0.083 1 mg/m L，可見(jiàn)，級(jí)分LP-30清除率較高.整體來(lái)看，各組樣品在0.02～0.2 mg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對(duì)自由基的清除率均隨質(zhì)量濃度的增大不斷增強(qiáng)，總清除活力大小順序?yàn)椋篤c＞LP-30＞LP-50＞LP-P＞LP-C.

（3）各組樣品對(duì)亞硝酸鹽的清除能力.亞硝酸鹽能夠與仲胺合成亞硝胺，而亞硝胺是一類(lèi)明確的化學(xué)致癌物，它能夠引起人體和動(dòng)物肝臟等多種器官的惡性腫瘤［14］.一次大劑量攝入亞硝酸鹽會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生急性亞硝酸鹽中毒，出現(xiàn)高鐵血紅蛋白癥；長(zhǎng)期低劑量攝入亞硝酸鹽則會(huì)導(dǎo)致慢性亞硝酸鹽中毒.可見(jiàn)，有效清除亞硝酸鹽對(duì)機(jī)體健康有重要意義.不同質(zhì)量濃度Vc和4組樣品對(duì)亞硝酸鹽的清除率影響如圖4所示.由圖4可以看出，Vc清除亞硝酸鹽活力均較其他組強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為0.1 mg/m L時(shí)，其清除率即達(dá)到92.57%，質(zhì)量濃度0.2 mg/ml時(shí)，清除率達(dá)到99.24%，這與庫(kù)爾班［15］對(duì)Vc的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.樣品組中，LP-50的IC50（0.055 2 mg/m L）比LP-30的IC50（0.059 7 mg/m L）略低，在質(zhì)量濃度0.02～0.1 mg/m L范圍內(nèi)，兩組的清除率分別從19.31%到87.64%和15.58%到83.63%，并且都顯示一定量效關(guān)系.值得注意的是，LP-C部分清除率大于LP-P，甚至在樣品質(zhì)量濃度0.02 mg/m L時(shí)，其清除率（22.56%）大于Vc清除率（16.18%）.類(lèi)似的，也有研究指出山竹殼粗多酚［14］的清除活力強(qiáng)于對(duì)照品Vc.整體來(lái)看，4組樣品對(duì)亞硝酸鹽均有顯著的清除活力，在質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/m L時(shí)，其清除率都達(dá)到97%以上.

圖3　不同質(zhì)量濃度Vc和4組樣品對(duì)羥基自由基的清除率

圖4　同質(zhì)量濃度Vc和4組樣品對(duì)亞硝酸鹽的清除率

2.3HPLC-DAD分析

樣品經(jīng)DAD檢測(cè)器在線(xiàn)紫外波長(zhǎng)掃描（210～400 nm），結(jié)合田娜［16］和Ye［17］等研究所用波長(zhǎng)，選擇360 nm為走樣檢測(cè)波長(zhǎng).兩級(jí)分和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分離圖譜如圖5、圖6所示.由圖5、圖6可以看出，在選定的色譜柱、流速、洗脫梯度等色譜條件下，級(jí)分LP-30各組分分離度較好，LP-50部分峰6與峰7間的分離度R達(dá)到1.30＞1，表明兩峰的分離程度大于98%.總體來(lái)看，選定的色譜條件對(duì)兩組樣品中有效成分均有較為理想的分離，有利于后續(xù)研究.

圖5　級(jí)分LP-30及標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的HPLC分離圖譜

圖6　級(jí)分LP-50及標(biāo)準(zhǔn)品金絲桃苷和槲皮素的HPLC分離圖譜

大多數(shù)黃酮類(lèi)化合物在紫外波長(zhǎng)掃描下呈現(xiàn)兩個(gè)特征吸收峰，一個(gè)在波長(zhǎng)300～400 nm范圍內(nèi)，稱(chēng)為帶Ⅰ，由B-環(huán)肉桂酰系統(tǒng)影響；另一個(gè)在波長(zhǎng)240～280 nm范圍內(nèi)，稱(chēng)為帶Ⅱ，由A-環(huán)苯酰系統(tǒng)影響.級(jí)分LP-30峰2和標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁，LP-50峰5和標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素的UV譜圖如圖7所示.由圖7可以看出，級(jí)分LP-30中，峰2保留時(shí)間（32.742 min）與蘆丁保留時(shí)間（32.693 min）很接近，調(diào)出峰2和蘆丁的UV譜圖（見(jiàn)圖7a）發(fā)現(xiàn)，峰2中出現(xiàn)兩吸收峰（255.6，354.5）分別介于300～400 nm范圍和240～280 nm范圍，與蘆丁類(lèi)似，表明峰2成分可能含有肉桂酰系統(tǒng)和苯?；?級(jí)分LP-50中，槲皮素出峰時(shí)間（23.970 min）與峰5（24.147 min）相近，調(diào)出峰5的UV譜圖（見(jiàn)圖7b）發(fā)現(xiàn)，峰5的兩吸收峰（254.4，362.8）同樣介于300～400 nm和240～280 nm范圍內(nèi)，與槲皮素類(lèi)似，表明峰5成分中可能也含有肉桂酰系統(tǒng)和苯?；?

圖7　級(jí)分LP-30峰2和標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁，LP-50峰5和標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素的UV譜圖

3　結(jié)論

荷葉多酚具有優(yōu)良的抗氧化活性.總還原力測(cè)定結(jié)果表明，總還原力大小與樣品質(zhì)量濃度有明顯的質(zhì)量濃度依賴(lài)效應(yīng)，4組樣品總還原力大小順序?yàn)椋篖P-P＞LP-30＞LP-50＞LP-C；在Fenton體系中，級(jí)分LP-30表現(xiàn)出最高的清除·OH能力，其IC50為0.059 3 mg/m L，比LP-50（0.083 1 mg/m L）略低，質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/m L時(shí)，清除率可達(dá)到71.12%；在清除亞硝酸鹽實(shí)驗(yàn)中，各組樣品均表現(xiàn)出較高的清除率，質(zhì)量濃度為0.1 mg/m L時(shí)，級(jí)分LP-50與LP-30的清除率隨即達(dá)到87.64%和83.63%.質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/m L時(shí)，各組樣品的清除率均可達(dá)到97%以上；HPLC-DAD分離結(jié)果表明，選定的色譜條件對(duì)LP-30和LP-50中活性組分分離較好，級(jí)分LP-30有3個(gè)主峰，LP-50有7個(gè)主峰.

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Study on in Vitro Antioxidant Activity of Polyphenols Extracted from Lotus Leaves

SUN Jian，CAI Wei-rong?，XIE Liang-liang，XU Hui-ling，SUN Tao-tao，TIAN Zheng
（College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

The researh aimed to investigate the antioxidant activity of polyphenols from lotus leaves.LP-C was the polyphenols extracted with 55%ethyl alcohol at a constant temperature and LP-P was the total polyphenols purified by AB-8 macroporous resins.LP-30 and LP-50 were obtained by gradiently eluting polyphenols absorbed on macroporous resins.Total reducing power，hydroxy radical scavenging rate and nitrite sacvenging rate were measured for the above four samples.In additon，the HPLC-DAD method was used to analyze constituents of LP-30 and LP-50 preliminarily.The four samples exhibited strong total reducing power，hydroxy radical scavenging activity and nitrite scavenging activity，which was obviously related to the concentration（0.02～0.2 mg/m L）.Three peaks in LP-30 and five peaks in LP-50 were determined by HPLC-DAD separation.Polyphenols in lotus leaves had excellent in vitro antioxidant activity.

lotus leaves；polyphenols；scavenging rate；antioxidant activity；HPLC-DAD

TS201.2

A

1672-2477（2016）04-0001-06

2016-01-10

安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（1408085 MC52）

孫建（1990-），男，河南信陽(yáng)人，碩士研究生.

蔡為榮（1963-），男，安徽蕪湖人，教授，碩導(dǎo).