陸振飛，楊俊鋒，王　慶，馬　勇，王建偉*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210023)

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不同濃度補(bǔ)腎中藥血清對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨活性的影響

陸振飛1，楊俊鋒1，王慶1，馬勇2，王建偉1*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210023)

目的觀察不同濃度補(bǔ)腎中藥血清對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨活性的影響，探討中藥血清濃度與成骨分化能力的相關(guān)性。方法制備低、中、高濃度補(bǔ)腎中藥大鼠血清，培養(yǎng)第3代人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，按誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中加入中藥血清濃度的不同及是否聯(lián)合骨形態(tài)蛋白(BMP-2)，分為基本培養(yǎng)基組(對(duì)照組)、5%中藥血清組、10%中藥血清組、15%中藥血清組、5%中藥血清+BMP-2組、10%中藥血清+BMP-2組、15%中藥血清+BMP-2組及BMP-2組，分別觀察各組堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素(BGP)含量及鈣離子濃度變化。結(jié)果低、高、中不同濃度中藥血清組分別在誘導(dǎo)第6、9天及第3、6天可提高ALP活性，10% 中藥血清組在誘導(dǎo)第9、12天能提高細(xì)胞內(nèi)BGP含量，而中藥血清聯(lián)合BMP-2后，ALP活性及BGP含量明顯提高，尤其以5%低濃度聯(lián)合組為明顯。各組成骨誘導(dǎo)第21天以激光共聚焦顯微鏡掃描細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，5%中藥血淸+BMP-2組、BMP-2組的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他各組，且5%中藥血淸+BMP-2組熒光強(qiáng)度最為明顯。結(jié)論不同濃度補(bǔ)腎中藥血清單獨(dú)誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用較弱，但聯(lián)合BMP-2后均能不同程度提高人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨活性，尤其以5%低濃度補(bǔ)腎中藥血淸為佳，且具有一定的協(xié)同促進(jìn)作用。

補(bǔ)腎中藥；血清；臍血；間充質(zhì)干細(xì)胞

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“腎藏精，主骨生髓”，腎精充足則骨髓化生有源，腎精虧虛則骨髓乏源，骨骼失養(yǎng)，則會(huì)產(chǎn)生“骨枯”或“骨痿”。由此可見(jiàn)，“腎”與“骨”常互為影響,腎精的盛衰與骨骼生理、病理有著密切聯(lián)系。目前，采用“補(bǔ)腎法”來(lái)促進(jìn)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化已成為骨組織工程研究新熱點(diǎn)。本研究篩選具有補(bǔ)腎益精健骨功效的14味補(bǔ)腎中藥制備低、中、高濃度大鼠血清作為誘導(dǎo)因子，有機(jī)結(jié)合BMP-2，以第3代人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討不同濃度補(bǔ)腎中藥血清對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨活性的影響。

1　材料與方法

1．1藥物、試劑及儀器補(bǔ)腎中藥為我院劉氏骨傷治療骨折、骨質(zhì)疏松傳承經(jīng)驗(yàn)方:生黃芪20 g，山茱萸10 g，淫羊藿10 g，骨碎補(bǔ)30 g，狗脊10 g，女貞子10 g，制附子9 g，蛇床子10 g，細(xì)辛6 g，白術(shù)10 g，白芍20 g，雞血藤15 g，鹿銜草15 g，生甘草9 g。均為顆粒劑，由江陰中藥廠生產(chǎn)，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供；低糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BMP-2(PEPROTECH,USA)；Fluo4-AM (株會(huì)社同仁化學(xué)研究所)；骨鈣素放免試劑盒(南京建成生物工程研究所)。倒置式系統(tǒng)相差顯微鏡(日本Olympus)；紫外分光光度儀(德國(guó)Eppendorf公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1．2補(bǔ)腎中藥血清制備取清潔級(jí)成年雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(200±20)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):SCXK(蘇)2008-0004。將補(bǔ)腎中藥濃煎至生藥含量2 g/mL，按250 mg/(kg·d)生藥劑量給大鼠灌胃，2次/d，連續(xù)7 d后頸動(dòng)脈取血，離心分離血清，56 ℃水浴30 min滅活，制成補(bǔ)腎中藥血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及傳代臍血取自足月正常分娩產(chǎn)婦，排除產(chǎn)婦、新生兒疾患，已經(jīng)過(guò)倫理鑒定，征得產(chǎn)婦及其家屬同意，由南京市婦幼保健院婦產(chǎn)科提供。無(wú)菌條件下，穿刺臍帶靠近胎盤(pán)處的臍靜脈，負(fù)壓抽吸臍靜脈血60～80 mL，肝素抗凝。與Hank’s液1∶1混勻，并將稀釋臍血按2∶1疊加于淋巴細(xì)胞分離液面上。離心后小心吸取淋巴細(xì)胞層(即第2層環(huán)狀乳白色)，用Hank’s平衡鹽溶液離心洗滌2次，棄上清。將細(xì)胞懸液接種于25 cm3培養(yǎng)瓶中，密度為1×106/mL。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后首次換液，后每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合時(shí)，按照1∶2進(jìn)行原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)，傳至第3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

1．4實(shí)驗(yàn)分組取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，用無(wú)血清LG-DMEM培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)細(xì)胞24 h，隨機(jī)分為8組，每組5個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)?？瞻讓?duì)照組(A組):加入含15%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的LG-DMEM完全培養(yǎng)基；5%中藥血清組(B組):加入含終濃度為5%補(bǔ)腎中藥血清、15%胎牛血清的LG-DMEM條件培養(yǎng)基；10%中藥血清組(C組):加入含終濃度10%補(bǔ)腎中藥血清、15%胎牛血清的LG-DMEM條件培養(yǎng)基；15%中藥血清組(D組):加入含終濃度15%補(bǔ)腎中藥血清、15%胎牛血清的LG-DMEM條件培養(yǎng)基；5%中藥血清+BMP-2組(E組):加入含終濃度為5%補(bǔ)腎中藥血清、50 ng/mL BMP-2、15%胎牛血清的LG-DMEM條件培養(yǎng)基；10%中藥血清+BMP-2組(F組):加入含終濃度10%補(bǔ)腎中藥血清、50 ng/mL BMP-2、15%胎牛血清的LG-DMEM條件培養(yǎng)基；15%中藥血清+BMP-2組(G組):加入含終濃度15%補(bǔ)腎中藥血清、50 ng/mL BMP-2、15%胎牛血清的LG-DMEM條件培養(yǎng)基；BMP-2組(H組):加入含終濃度50 ng/mL BMP-2、15%胎牛血清的LG-DMEM條件培養(yǎng)基。

1．5堿性磷酸酶活性檢測(cè)于誘導(dǎo)培養(yǎng)后第3、6、9、12天，標(biāo)記3支EP管為測(cè)定管、空白管、標(biāo)準(zhǔn)管，分別加入細(xì)胞上清液、雙蒸水及酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液各50 μL，然后分別在各管中依次加入緩沖液、基質(zhì)液各0．5 mL，充分混勻，37 ℃水浴15 min，再滴入顯色劑1．5 mL，在紫光分光儀上均以520 nm、0．5 cm光徑比色，檢測(cè)比較各管的吸光度(OD值)。

1．6骨鈣素活性檢測(cè)于誘導(dǎo)培養(yǎng)后第3、6、9、12天，根據(jù)骨鈣素放免試劑盒，取各組細(xì)胞上清液100 μL，骨鈣素抗體可分別與標(biāo)記有125I的骨鈣素和標(biāo)本中的骨鈣素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，采用分離劑將結(jié)合抗體沉淀，4 ℃離心后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線得到標(biāo)本中骨鈣素的含量。

1．7鈣離子分泌檢測(cè)于誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，HBSS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，加入F1U04-AM工作液，37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，去除Fluo4-AM工作液，加入細(xì)胞緩沖液覆蓋細(xì)胞，然后再次在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育約30 min，采用激光共聚焦顯微鏡掃描檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光鈣離子濃度變化，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為516 nm。

2　結(jié)果

2．1人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)示:人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞能穩(wěn)定的表達(dá)CD29、CD44、CD105，但不表達(dá)造血細(xì)胞系的表面標(biāo)記 CD34、CD45，與源于骨髓的MSCs 表面抗原標(biāo)記相一致。

2．2堿性磷酸酶活性各組在誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、6、9、12天ALP活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　各誘導(dǎo)組不同時(shí)間點(diǎn)的堿性磷酸酶活性±s，n=5)　金氏單位/100 mL

注:與對(duì)照組比較，#P<0．05,##P<0．01；與BMP-2組比較，△P<0．05；與10%、15%中藥血清+BMP-2組比較，▲P<0．05

2．3骨鈣素含量各組在誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、6、9、12天骨鈣素RIA法活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　各組誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)骨鈣素含量　ng/mL

注:與對(duì)照組比較，#P<0．05,##P<0．01

2．4鈣離子分泌各組在誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天時(shí)，激光共聚焦顯微鏡掃描細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。其中5%中藥血清+BMP-2組與BMP-2組的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其余各組，而5%中藥血清+BMP-2組熒光強(qiáng)度尤為顯著。

3　討論

近年來(lái)，由于人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)具有多向分化潛能，且具有取材方便，免疫源性低，多代擴(kuò)增后仍保持干細(xì)胞的特性，且不易被病毒感染等優(yōu)點(diǎn)，目前作為新型種子細(xì)胞已成為研究熱點(diǎn)[1-3]。但是，由于臍血中間充質(zhì)干細(xì)胞含量較低，有研究報(bào)道[2,4]每106個(gè)單核細(xì)胞中平均只有 0．05～2．8個(gè)MSCs，且成骨活性較弱，骨化過(guò)程較慢，所以，如何提高h(yuǎn)UCB-MSCs 的成骨潛能，使其高效地向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是骨組織工程的研究關(guān)鍵[5-6]。本實(shí)驗(yàn)選取骨碎補(bǔ)、狗脊等14味補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2作為臍血間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化誘導(dǎo)分化劑取得了良好的效果。

目前，堿性磷酸酶活性、骨鈣素含量及鈣離子濃度被認(rèn)為是衡量干細(xì)胞成骨分化活性的重要標(biāo)志[6,7-11]。本實(shí)驗(yàn)以DMEM完全培養(yǎng)基為對(duì)照組，通過(guò)設(shè)計(jì)低、中、高濃度補(bǔ)腎中藥血清組、BMP-2組及不同濃度補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2各組，研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)補(bǔ)腎中藥血清雖然在不同時(shí)間點(diǎn)可一定程度增加堿性磷酸酶活性和骨鈣素含量，但其作用較弱，且各時(shí)間點(diǎn)規(guī)律性不強(qiáng),但聯(lián)合BMP-2后可明顯提高人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨活性，尤其是5%低濃度補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2組能全面提高堿性磷酸酶活性、骨鈣素含量及鈣離子濃度，在部分時(shí)間點(diǎn)明顯優(yōu)于單獨(dú)BMP-2誘導(dǎo)組，顯示出適宜濃度的補(bǔ)腎中藥血清對(duì)BMP-2誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化有一定的協(xié)同促進(jìn)作用。

人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)成骨活性影響因素眾多，除了誘導(dǎo)因子的選擇外，還涉及人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)等各個(gè)環(huán)節(jié)，包括分離方法的選擇、接種密度、培養(yǎng)基的選擇等。如何提高人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)成骨分化，補(bǔ)腎中藥血清加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基成為一個(gè)新的選擇，而低濃度中藥血清顯然對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基微環(huán)境的改善作用更加明確，其作用機(jī)制可能為:補(bǔ)腎中藥能提高Cbfal mRNA,BMP-2 mRNA等基因的表達(dá)或增強(qiáng)BMP-2等因子的活性，促使定向分化出的hUCB-MSCs分泌ALP、BGP，促進(jìn)鈣磷在骨表面沉積，從而達(dá)到提高h(yuǎn)UCB-MSCs的成骨分化[12]。

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Different concentration of kidney-tonifying Chinese herbal serum on osteogenic activity in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells

LU Zhenfei1,YANG Junfeng1,WANG Qing1,MA Yong2,WANG Jianwei1*

(1.Wuxi Hospital of TCM Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine,Wuxi 214000,Jiangsu Province,China;2.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)

ObjectiveTo observe the effect of different concentration of kidney-tonifying Chinese herbs on osteogenic activity in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells in vitro,explore the correlation between serum concentration and osteogenic differentiation ability.MethodsThe low,medium and high concentration of kidney-tonifying Chinese herbal serum in rats were prepared,and the third generations of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells were cultured.According to the difference of concentration of Chinese herbal serum,which was added to the differentiation medium,and whether bone morphogenetic protein (BMP-2) combined with them,the experiment could be divided into the basic culture medium group (the control group),5% drug group,10% drug group,15% drug group,5% drug+BMP-2 group,10% drug+BMP-2 group,15% drug+BMP-2 group and BMP-2 group.Then alkaline phosphatase (ALP) activity,the content of osteocalcin (BGP) and the concentration of calcium ion in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells were observed.ResultsLow,high and moderate concentration of drug serum groups respectively could increase the activity of ALP in the induction of 6 d,9 d and 3,6 d,10% drug group could increase the content of BGP in the induction of 9,12 d,ALP activity and BGP content increased significantly after combining with BMP-2,especially in 5% low concentration group which combined with BMP-2.The concentration change of calcium ion in cells could be observed in the induction of 21D by laser confocal scanning microscope,the fluorescence intensity in 5% drug+BMP-2 group and BMP-2 group was significantly better than other groups,and the 5% drug+BMP-2 group was the most obvious.ConclusionThe effect of osteoblastic differentiation was very poor by different concentration of kidney-tonifying Chinese herbal serum alone in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,but osteogenic activity increased significantly after combining with BMP-2,especially the 5% low concentration group combined with BMP-2 was better,which has some synergistic effect in some degree.

kidney-tonifying Chinese herbs;serum;umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;osteogenic activity

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.010

江蘇省中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才培養(yǎng)對(duì)象資助項(xiàng)目(LJ200924)。

陸振飛(1979-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事骨傷研究及運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)。

王建偉，主任醫(yī)師，電話-13093000801，電子信箱-singer1980@sina.com

R285.5

A

2095-6258(2016)04-0688-04

2015-11-03)