劉城，　宋雨鴻，　王月剛，　裴靜嫻，　賴艷嫻，　申艷

（廣州市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州　510180）

柔毛水楊梅對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管能力的影響

劉城，宋雨鴻，王月剛，裴靜嫻，賴艷嫻，申艷

（廣州市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州510180）

【目的】 研究柔毛水楊梅對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管能力的影響?！痉椒ā繉⒉煌瑵舛龋?～200 ng/mL）柔毛水楊梅作用于人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMVEC-Ls），分別采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，劃痕法檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，Matrigel法檢測(cè)細(xì)胞的成管能力以及Western blot法驗(yàn)證低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）的表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】MTS結(jié)果顯示：柔毛水楊梅與HMVEC-Ls共同培養(yǎng)7 d，25～200 ng/mL不同濃度組均可促進(jìn)HMVEC-Ls增殖，與對(duì)照組（0 ng/mL）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以100 ng/mL組促進(jìn)HMVEC-Ls增殖能力最顯著（P＜0.05）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，50～150 ng/mL組HMVEC-Ls遷移率顯著增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以150 ng/mL組HMVEC-Ls遷移率最高。成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組比較，50～150 ng/mL組HMVECLs成管長(zhǎng)度顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），亦以150 ng/mL組HMVEC-Ls成管長(zhǎng)度最大。Western blot檢測(cè)結(jié)果：與對(duì)照組比較，150 ng/mL柔毛水楊梅濃度組HIF-1α、TERT和VEGF表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）?！窘Y(jié)論】柔毛水楊梅可通過促進(jìn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管樣形成而發(fā)揮促血管新生效應(yīng)，其機(jī)制可能與HIF-1α-TERT-VEGF途徑介導(dǎo)的血管新生有關(guān)。

柔毛水楊梅；人微血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管新生；細(xì)胞培養(yǎng)

血管新生是機(jī)體對(duì)組織缺氧的一個(gè)適應(yīng)性反應(yīng)，在一系列的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，如：胚胎發(fā)育、傷口愈合、炎癥、腫瘤生長(zhǎng)和血管瘤的形成等［1］。促血管新生已成為缺血性血管疾?。ㄈ纾汗谛牟?、缺血性腦血管病以及外周血管?。┑闹委熜路较颍?］。柔毛水楊梅（Geum japonicum Thunb. var.chinense F.Bolle，GJ）是薔薇科路邊青屬植物，性寒，味苦、辛，功能補(bǔ)腎平肝、活血消腫，目前還發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的促血管新生效能，但國(guó)內(nèi)外對(duì)柔毛水楊梅的促血管新生研究相對(duì)較少。本研究擬通過觀察柔毛水楊梅對(duì)體外培養(yǎng)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMVEC-Ls）增殖、遷移、成管能力的影響，并同時(shí)對(duì)低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）等促血管新生基因或相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期初步探討柔毛水楊梅促血管新生的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1藥物、試劑與儀器柔毛水楊梅為柔毛水楊梅全草（購自貴州省貴陽市孟關(guān)地區(qū)）的甲醇提取物［3］；HMVEC-Ls及其專用培養(yǎng)基（美國(guó)Clonetics公司）；CellTiter 96 Assay MTS/PES試劑盒（美國(guó)Promega公司）；Growth factor-reduced Matrigel（美國(guó)BD Bioscience公司）；鼠抗人β-actin單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；鼠抗人HIF-1α、TERT 及VEGF單克隆抗體（美國(guó)Chemicon公司），2.5 g/L胰酶溶液 ［不含乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）］/（含EDTA）（美國(guó)Gibco公司）；細(xì)胞用1285型生物安全柜（美國(guó)Thermo公司）；TS100-F型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Z2型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；550伯樂550酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；全自動(dòng)Western blot實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司）。

1.2細(xì)胞增殖評(píng)價(jià)96孔板中以2.0×103cells/孔的密度鋪板。8 h后換成HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基維持24 h，將柔毛水楊梅用HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（不含F(xiàn)BS和生長(zhǎng)因子）進(jìn)行不同濃度梯度的倍比稀釋后每孔加入100 μL，使終濃度分別為0、25、50、75、100、150、200 ng/mL，種植在96孔培養(yǎng)板中，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組每次為6個(gè)孔，分別于接種后的第7天應(yīng)用MTS/PES試劑盒測(cè)細(xì)胞增殖率。在Bio-Rad 550型酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（D），細(xì)胞增殖能力用細(xì)胞增殖率表示：p細(xì)胞增殖（%）＝D給藥組/D對(duì)照組×100%。

1.3劃痕實(shí)驗(yàn)將HMVEC-Ls以1.0×104cells/皿的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，并置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h以形成完全融合的單細(xì)胞層，于白紙上每隔3 mm劃平行線，將完全融合的HMVEC-L培養(yǎng)皿置于其上，使用200 μL無菌吸頭沿線進(jìn)行劃痕；然后用PBS輕輕洗去脫落細(xì)胞碎片，用分別含有0、50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅的HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（不含F(xiàn)BS和生長(zhǎng)因子）并置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度中繼續(xù)培養(yǎng)；于12 h后拍照并使用圖像分析軟件IPP 6.1分析。細(xì)胞遷移能力以遷移率表示：p細(xì)胞遷移（%）＝（原劃痕面積－殘留面積）/原劃痕面積×100%。

1.4成管實(shí)驗(yàn)將Matrigel基質(zhì)膠及96孔板置于4℃冰箱中過夜，向預(yù)冷的96孔板中加入Matrigel基質(zhì)膠，每孔80 μL，37℃放置 2 h成膠。將HMVEC-Ls以1.0×104cells/孔的密度接種于預(yù)先由Matrigel基質(zhì)膠包被的96孔板中并置于37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后，立即更換為含有0、50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅的HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（不含F(xiàn)BS和生長(zhǎng)因子）繼續(xù)培養(yǎng)；于12 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察管樣結(jié)構(gòu)并用圖像分析軟件IPP 6.1分析。細(xì)胞成管能力以每視野（×100）下所有管樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度之和表示：l成管（mm/視野）=Σ（l1+l2+…+ln）/視野。

1.5Western blot檢測(cè)HIF-1α、TERT、VEGF的表達(dá)HMVEC-Ls以1×105接種到75 cm2培養(yǎng)瓶并置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，8 h后更換為HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)2%FBS，不含生長(zhǎng)因子）繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后再次更換為分別含有0、50、100、150 μg/mL柔毛水楊梅的HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（2%FBS，不含生長(zhǎng)因子）繼續(xù)培養(yǎng)；96 h后分別收集細(xì)胞，用預(yù)冷的RIPA液裂解細(xì)胞，離心后，取上清測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果采用光密度掃描儀掃描、影像軟件Gel-pro analysis分析，用目的條帶的灰度值代表表達(dá)量，灰度值=面積×密度。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用One-way ANOVA方差分析。方差齊性時(shí)組間比較采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Games-Howell檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1柔毛水楊梅對(duì)HMVEC-Ls增殖的影響如圖1所示，將不同濃度的柔毛水楊梅與HMVEC-Ls共同孵育7 d后，不同濃度柔毛水楊梅均能顯著促進(jìn)HMVEC-Ls增殖（P＜0.05）。當(dāng)柔毛水楊梅濃度＜100 ng/mL時(shí)，HMVEC-Ls的細(xì)胞生長(zhǎng)率隨柔毛水楊梅濃度的增加而增高（P＜0.05），呈明顯的濃度依賴關(guān)系。但當(dāng)柔毛水楊梅濃度＞100 ng/mL后，HMVEC-Ls的細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著下降（P＜0.05）。

圖1　不同濃度柔毛水楊梅對(duì)HMVEC-Ls增殖的影響Figure 1　Effects of GJ at various concentrations on HMVEC-Ls proliferation?。ā纒，n=6）

2.2柔毛水楊梅對(duì)HMVEC-Ls遷移的影響圖2、圖3結(jié)果顯示：與0 ng/mL柔毛水楊梅組比較，50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅組HMVEC-Ls遷移率顯著增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且以150 ng/mL柔毛水楊梅組遷移能力最強(qiáng)（P＜0.05）。說明柔毛水楊梅能促進(jìn)HMVEC-Ls遷移，且促HMVEC-Ls遷移的能力隨濃度增加而增強(qiáng)。

圖2　不同濃度柔毛水楊梅對(duì)HMVEC-Ls遷移的形態(tài)學(xué)觀察（×100）Figure 2　The histological feature of HMVEC-Ls migration affected by different concentrations of GJ（×100）

2.3柔毛水楊梅對(duì)HMVEC-Ls成管的影響圖4結(jié)果顯示：HMVEC-Ls細(xì)胞接種于Matrigel基質(zhì)膠后起始呈圓形或卵圓形，1～2 h后各濃度柔毛水楊梅組HMVEC-Ls細(xì)胞逐漸伸展開并伸出突起，4～5 h后相鄰?fù)黄鹣嗷ミB接形成小管樣結(jié)構(gòu)。圖5結(jié)果顯示：與0 ng/mL柔毛水楊梅組比較，50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅組成管長(zhǎng)度顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且以150 ng/mL柔毛水楊梅組成管長(zhǎng)度最長(zhǎng)（P＜0.05）。表明柔毛水楊梅能促HMVEC-Ls成管，且促HMVEC-Ls成管的能力隨濃度增加而增強(qiáng)。

2.4柔毛水楊梅對(duì)HIF-1α、TERT及VEGF表達(dá)的影響圖6、圖7結(jié)果顯示：與0 ng/mL柔毛水楊梅組比較，50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅組HIF-1α蛋白表達(dá)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，與0、50 ng/mL柔毛水楊梅組比較，100、150 ng/mL柔毛水楊梅組TERT的表達(dá)亦顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而150 ng/mL柔毛水楊梅組VEGF的表達(dá)顯著高于0、50、100 ng/mL柔毛水楊梅濃度組（均P＜0.05）。而且在150 ng/mL柔毛水楊梅組，HIF-1α、TERT及VEGF的表達(dá)均最強(qiáng)。

圖3　不同濃度柔毛水楊梅對(duì)HMVEC-Ls遷移的影響Figure 3　Effects of GJ at various concentrations on HMVEC-Ls migration?。ā纒，n=6）

圖4　不同濃度柔毛水楊梅對(duì)HMVEC-Ls成管的形態(tài)學(xué)觀察（×100）Figure 4 The histological feature of HMVEC－Ls tube formation affected by different concentrations of GJ（×100）

圖5　不同濃度柔毛水楊梅對(duì)HMVEC-Ls成管的影響Figure 5　Effects of GJ at various concentrations on HMVEC-Ls tube formation?。ā纒，n=6）

圖6　不同濃度柔毛水楊梅下HIF-1α、TERT 及VEGF蛋白表達(dá)的變化Figure 6　Protein expression levels of HIF-1α，TERT and VEGF in HMVEC-Ls treatd with GJ at various concentrations

圖7　不同濃度柔毛水楊梅對(duì)HIF-1α、TERT及VEGF表達(dá)的影響Figure 7　Effects of GJ at various concentrations on the expression levels of HIF-1α，TERT and VEGF

3　討論

缺血性血管疾病的預(yù)后與相應(yīng)缺血區(qū)域內(nèi)靶血管的側(cè)支循環(huán)狀況密切相關(guān)，近年來在缺血性血管疾病的防治從單純改變病變血管供血轉(zhuǎn)向如何促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，中藥促血管新生治療有望為促側(cè)支循環(huán)的建立開辟新的途徑，成為目前缺血性血管疾病治療中具有發(fā)展前景的新方向［2］。血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖、遷移、管樣形成以及毛細(xì)血管發(fā)芽等過程［4］，僅依靠單一的促血管新生因子很難完成［5］。HIF-1α作為一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能直接或間接地調(diào)控VEGF等100多種下游促血管新生靶基因參與血管新生過程，具有“總開關(guān)”的特點(diǎn)，是血管新生的中心環(huán)節(jié)［6］。篩選出一種中藥能激活HIF-1α并經(jīng)HIF-1α誘導(dǎo)血管新生途徑促血管新生，且弄清其分子調(diào)控機(jī)制是未來研究的主要方向。本研究發(fā)現(xiàn)：在不同濃度柔毛水楊梅的作用下，HMVEC-Ls的增殖、遷移、成管能力增加，且具有濃度依賴性，這表明柔毛水楊梅具有較強(qiáng)的促血管新生的活性，在治療性血管新生領(lǐng)域具有良好研發(fā)前景，但其機(jī)制仍不清楚。

HIF-1與下游促血管新生靶基因的VEGF組成的HIF-1α-VEGF途徑在血管新生的病理生理過程中最具有代表性［7］。另外一方面，最初認(rèn)為機(jī)體內(nèi)所有內(nèi)皮細(xì)胞都是均質(zhì)的，但實(shí)質(zhì)上內(nèi)皮細(xì)胞間還具有功能的異質(zhì)［8］。尤其是在病理狀態(tài)下（如缺血性血管疾病），血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)老化和功能減弱［9］，而通過端粒酶激活可以逆轉(zhuǎn)這種衰老、增加增殖能力［10］。TERT基因的表達(dá)水平對(duì)端粒酶的活性起關(guān)鍵作用［11］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)低氧條件下HIF-1α直接介導(dǎo)TERT表達(dá)上調(diào)［12］，且TERT在VEGF誘導(dǎo)的血管新生中起“催化劑”的作用［13］。由此推論：柔毛水楊梅可能經(jīng)HIF-1α-TERTVEGF途徑促血管新生。為驗(yàn)證前述假設(shè)，本研究運(yùn)用Western blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)柔毛水楊梅能上調(diào)HIF-1α表達(dá)，而作為HIF-1α下游促血管新生靶基因的VEGF，其表達(dá)則隨HIF-1α的表達(dá)上調(diào)而上調(diào)。與此同時(shí)，治療性血管新生中維護(hù)靶細(xì)胞微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素——TERT的表達(dá)在該過程中亦上調(diào)，且與其上調(diào)HIF-1α、VEGF表達(dá)具有一致性。說明柔毛水楊梅促血管新生效應(yīng)與HIF-1α-TERT-VEGF途徑誘導(dǎo)的血管新生有關(guān)。然而，HIF-1α、TERT、VEGF之間的調(diào)節(jié)關(guān)系目前仍不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，柔毛水楊梅可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖、遷移、管樣形成從而發(fā)揮促血管新生效應(yīng)，為治療性血管新生帶來新希望。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Effect of Geum japonicum Thunb.var.chinense F.Bolle on Proliferation，Migratio and Tube Formation of Human Microvascular Endothelial Cellsin Vitro

LIU Cheng，SONG Yuhong，WANG Yuegang，PEI Jingxian，LAI Yanxian， SHEN Yan
（Dept.of Cardiology，Guangzhou First People’s Hospital，Guangzhou 510180 Guangdong，China）

ObjectiveTo study the effects of Geum japonicum Thunb.var.chinense F.Bolle（GJ）on the proliferation，migration and tube formation of human microvascular endothelial cells（HMVEC-Ls）in vitro. Methods The HMVEC-Ls were treated with different concentrations of GJ methanol extract.HMVEC-Ls proliferation，migration and tube formation were measured by MTS assay，wound-healing cell migration assay and Matrigel assay，respectively.The effect of GJ methanol extract on the expression levels of hypoxia inducible factor 1α（HIF-1α），telomerase reverse transcriptase（TERT）and vascular endothelial growth factor（VEGF）were detected by Western blotting method.Results MTS results showed that HMVEC-Ls proliferation index in 25-200 ng/mL of GJ groups was increased（P＜0.05 as compared with that of the control group），the effect of 100 ng/mL of GJ group being the best.HMVEC-Ls migration ratio in 50-150 ng/mL of GJ groups was enhanced（P＜0.05 as compared with that of the control group），the effect of 150 ng/mL of GJ group being the best.The tube length of HMVEC-Ls in 50-150 ng/mL of GJ groups was enhanced（P＜0.05 as compared with that of the control group），the effect of 150 ng/mL of GJ group being the best.In addition，HIF-1α，TERT and VEGF protein expression levels were also significantly up-regulated by GJ（P＜0.05）.Conclusion GJ can promote HMVEC-Ls proliferation，migration and tube formation，and the mechanism is related with angiogenesis mediated by HIF-1α-TERT-VEGF pathway.

Geum japonicum Thunb.var.chinense F.Bolle（GJ）；human microvascular endothelial cells （HMVEC-Ls）；angiogenesis；cell culture

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0551-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.025

2016-02-12

劉城（1981-），男，副主任醫(yī)師；E-mail：adrian_liu@msn.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81100235）