仇登高, 徐世宏, 劉 鷹, 6, 宋昌斌, 遲 良, 王順奎, 于凱松

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超聲成像技術(shù)在大西洋鮭早期性別及發(fā)育期鑒別的應(yīng)用研究

仇登高1, 2, 5, 徐世宏1, 5, 劉 鷹1, 5, 6, 宋昌斌3, 遲 良1, 王順奎4, 于凱松4

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 福建省水產(chǎn)研究所 福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門(mén) 361013; 3. 中國(guó)科學(xué)院 半導(dǎo)體研究所, 北京 100083; 4. 山東東方海洋科技股份有限公司, 山東 煙臺(tái) 264003; 5. 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 6. 大連海洋大學(xué), 遼寧 大連 116023)

采用KX-5100便攜式B超機(jī)(7.5MHz高頻線陣探頭)對(duì)273尾1齡或2齡大西洋鮭()的性別及性腺發(fā)育階段進(jìn)行了檢測(cè), 同時(shí)對(duì)檢測(cè)的大西洋鮭進(jìn)行了解剖和取樣, 利用組織學(xué)觀察法驗(yàn)證了超聲成像技術(shù)對(duì)大西洋鮭雌雄性別和發(fā)育階段的鑒別結(jié)果。研究結(jié)果顯示: 利用超聲成像技術(shù)鑒別雌、雄大西洋鮭的平均準(zhǔn)確率為86%, 且鑒別雌魚(yú)的準(zhǔn)確率(93%)較雄魚(yú)(81%)高。超聲成像技術(shù)鑒別Ⅱ期+Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期卵巢的準(zhǔn)確率分別為87%、92%和100%, 鑒別Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期精巢的準(zhǔn)確率分別為64%、71%、86%和84%?？傮w看來(lái), 超聲成像技術(shù)鑒別早期性腺(Ⅱ期~Ⅲ期)發(fā)育的準(zhǔn)確率較低, 僅為75%, 而對(duì)晚期性腺(Ⅳ期~Ⅴ期)發(fā)育鑒別的準(zhǔn)確率較高, 達(dá)到89%。

超聲成像技術(shù); 大西洋鮭(); 早期性別鑒別; 性腺發(fā)育階段

大西洋鮭()屬鮭形目(Salmonifomes)、鮭科(Salmonidae)、鮭屬(), 為世界范圍養(yǎng)殖的冷水性魚(yú)類。大西洋鮭在性成熟階段, 雌魚(yú)體色會(huì)變成棕色或黃色, 雄魚(yú)鱗片上的黑色斑點(diǎn)變?yōu)榧t色, 上下頜延長(zhǎng)并彎曲成鉤狀[1]。但是, 在性腺開(kāi)始發(fā)育初期, 雌、雄個(gè)體的第二性征不明顯, 從外部形態(tài)難以鑒別其性別和性腺發(fā)育期, 而在同池飼養(yǎng)的過(guò)程中, 雌、雄大西洋鮭可以各自分泌性激素誘導(dǎo)對(duì)方性腺成熟[2], 造成大西洋鮭的生長(zhǎng)趨緩、魚(yú)肉品質(zhì)下降等問(wèn)題。因此, 如何快速準(zhǔn)確地鑒別大西洋鮭早期性別對(duì)促進(jìn)科學(xué)管理和精準(zhǔn)養(yǎng)殖十分有必要。目前, 國(guó)內(nèi)外傳統(tǒng)的性別鑒別技術(shù)主要有腹腔外科手術(shù)法[3]、內(nèi)窺鏡法[4]、卵黃蛋白濃度分析法[5]、放射免疫測(cè)定法[6]等。這些檢測(cè)技術(shù)盡管可以獲得比較高的鑒別準(zhǔn)確率, 但是耗時(shí)較長(zhǎng)且工作量較大, 并且還要侵入魚(yú)類體內(nèi), 容易造成細(xì)菌等微生物的感染, 甚至可能導(dǎo)致檢測(cè)魚(yú)的死亡[7]。相比之下, 超聲成像技術(shù)是一項(xiàng)無(wú)損傷、速度較快、準(zhǔn)確率高的檢測(cè)技術(shù), 當(dāng)前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和獸醫(yī)行業(yè)。國(guó)外一些學(xué)者將超聲成像技術(shù)引入到魚(yú)類養(yǎng)殖領(lǐng)域, 如Shields[8]等采用超聲波診斷技術(shù)檢測(cè)了庸鰈()卵母細(xì)胞成熟程度和排卵期; Blythe[9]等超聲檢查了條紋狼鱸()雌雄性別和成熟狀況;

Wildhaber[10]等報(bào)道了超聲鑒別亞拉巴馬鏟鱘()性別技術(shù); Mattson[11]初步建立了超聲波掃描技術(shù)鑒別大西洋鮭性別和性腺大小的方法, 同時(shí)作者指出超聲圖像質(zhì)量和測(cè)量可靠性需要進(jìn)一步改進(jìn)和提高。目前, 隨著科學(xué)技術(shù)的飛躍發(fā)展, 超聲成像技術(shù)已升級(jí)換代, 有必要采用現(xiàn)代的、圖像更為清晰細(xì)膩的便攜式超聲診斷儀進(jìn)一步優(yōu)化大西洋鮭早期性別及性腺發(fā)育階段的無(wú)損鑒別技術(shù)?；谏鲜隹紤], 作者通過(guò)超聲成像技術(shù)檢測(cè)大西洋鮭的性別和性腺發(fā)育階段, 掌握不同發(fā)育階段卵巢和精巢的超聲波圖像特征, 以期為超聲波檢測(cè)技術(shù)在中國(guó)魚(yú)類養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)

實(shí)驗(yàn)所用大西洋鮭于2012年4月~12月取自山東東方海洋科技股份有限公司開(kāi)發(fā)區(qū)分公司魚(yú)類研究中心, 隨機(jī)取1~2齡大西洋鮭273尾, 體質(zhì)量為200~2 880 g, 體長(zhǎng)為25.2~54.5 cm。

1.2 方法

1.2.1 儀器

采用徐州市凱信電子設(shè)備有限公司生產(chǎn)的全數(shù)字B超診斷儀KX5100。探頭選擇線陣寬頻探頭, 頻率為7.5 MHz, 掃描深度選擇為6~24 cm。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)魚(yú)飼養(yǎng)環(huán)境

降海后的大西洋鮭飼養(yǎng)在水溫相對(duì)恒定的循環(huán)水養(yǎng)殖生產(chǎn)系統(tǒng)的八邊形水泥池內(nèi), 養(yǎng)殖池規(guī)格為長(zhǎng)7 m、寬7 m、深2.3~2.5 m, 養(yǎng)殖期間鹽度為28±2.7, 水溫為13.6~15.0℃。

1.2.3 操作方法

取樣前將實(shí)驗(yàn)魚(yú)用MS-222(20 ppm ~40 ppm)麻醉, 待大西洋鮭安靜不掙扎時(shí), 采用KX-5100超聲波診斷儀(線陣高頻探頭, 7.5 MHz)進(jìn)行性腺的超聲波掃描并拍照。檢測(cè)時(shí), 被檢測(cè)魚(yú)側(cè)放于光滑的桌面, 魚(yú)的腹部朝向操作者, 操作者手持探頭, 將探頭對(duì)準(zhǔn)脊椎方向, 并緊貼魚(yú)體鰓蓋后緣呈45°進(jìn)行測(cè)量, 輕輕擺動(dòng)探頭以獲得較清晰的圖像(圖1)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 大西洋鮭不同性腺發(fā)育階段的超聲圖像特征及檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí), 雌性大西洋鮭(200~300g)超聲成像技術(shù)獲得的卵巢超聲圖像呈小三角形(圖2-1)。對(duì)應(yīng)的組織學(xué)觀察顯示, 在數(shù)量和面積上, 卵巢內(nèi)部主要以第2時(shí)相初級(jí)卵母細(xì)胞為主(圖2-2)。卵巢進(jìn)入Ⅲ期時(shí), 超聲成像技術(shù)所得到的圖像呈類似三角形的形狀, 結(jié)構(gòu)較緊密(圖2-3)。對(duì)應(yīng)組織學(xué)觀察顯示, 此期卵巢內(nèi)生殖細(xì)胞以第3時(shí)相進(jìn)入大生長(zhǎng)期的初級(jí)卵母細(xì)胞為主, 細(xì)胞體積明顯變大。圖2-4顯示Ⅲ期中初級(jí)卵母細(xì)胞, 細(xì)胞近似橢圓形, 伴隨細(xì)胞的發(fā)育核仁增大, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有卵黃顆粒, 分布在細(xì)胞質(zhì)的部分區(qū)域, 此期細(xì)胞核還未出現(xiàn)極化現(xiàn)象。卵巢發(fā)育至第4時(shí)相早期時(shí), 該期超聲波圖像類似于Ⅲ期, 呈三角形。當(dāng)卵巢發(fā)育進(jìn)入第4時(shí)相中、后期及第5時(shí)相時(shí), 此階段超聲波圖像顯示卵巢位于腎臟的一側(cè), 在圖像上可清楚地看到白色圓形亮點(diǎn)結(jié)構(gòu), 該亮點(diǎn)為卵細(xì)胞(圖2-5)。對(duì)應(yīng)組織學(xué)觀察顯示, Ⅳ期卵巢內(nèi)生殖細(xì)胞主要以第4時(shí)相初級(jí)卵母細(xì)胞為主, 按照卵母細(xì)胞的核偏移情況將此期卵母細(xì)胞分成早、中、晚3個(gè)階段。圖2-6顯示卵細(xì)胞發(fā)育至第4時(shí)相后期階段, 細(xì)胞核極化, 且抵達(dá)動(dòng)物極。圖2-7、2-8分別為Ⅴ期卵巢超聲圖像和相應(yīng)的組織學(xué)觀察。因此, 可通過(guò)性腺在超聲波圖像上所呈的三角形或白色圓形顆粒結(jié)構(gòu)作為雌性大西洋鮭未成熟與成熟的判別標(biāo)準(zhǔn), 也可作為雌雄鑒別的標(biāo)準(zhǔn)。

雄性大西洋鮭(約200g)精巢為Ⅱ期, 這個(gè)時(shí)期精巢在超聲波圖像上看不出明顯的特征(圖3-1)。對(duì)應(yīng)組織學(xué)觀察顯示, Ⅱ期精巢的精小葉內(nèi)含有初級(jí)精原細(xì)胞和次級(jí)精原細(xì)胞, 初級(jí)精原細(xì)胞單個(gè)位于精小葉邊緣, 核膜比較清晰, 中心位置有一核仁, 次級(jí)精原細(xì)胞由初級(jí)精原細(xì)胞分裂而來(lái), 往往位于精小葉內(nèi)部的精小囊中(圖3-2)。圖3-3顯示Ⅲ期精巢的超聲波圖像也無(wú)明顯的特征, 圖3-4為此時(shí)圖像所對(duì)應(yīng)的組織學(xué)觀察。當(dāng)精巢發(fā)育至Ⅳ期時(shí), 此期的超聲波圖像顯示精巢在腎臟的上部, 呈現(xiàn)不規(guī)則黑影(圖3-5)。對(duì)應(yīng)的組織學(xué)觀察顯示, 發(fā)育至Ⅳ期的精巢開(kāi)始出現(xiàn)少量的精子, 但是精小葉內(nèi)部精子細(xì)胞占很大部分, 另還含有少量的初級(jí)精母細(xì)胞及次級(jí)精母細(xì)胞。此階段的精子細(xì)胞排列比較緊密, 發(fā)育基本上處于同步狀態(tài), 精子細(xì)胞的著色比初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞要深, 嗜堿性能力較強(qiáng)(圖3-6)。圖3-7、3-8分別為Ⅴ期精巢超聲圖像和相應(yīng)的組織學(xué)觀察。因此, 可通過(guò)觀察精巢在B超診斷儀上所呈現(xiàn)出不規(guī)則黑影的超聲波圖像作為雄性大西洋鮭成熟的判別標(biāo)準(zhǔn)。

2-1. Ⅱ期卵巢超聲波圖像; 2-2. Ⅱ期卵巢; 2-3. Ⅲ期卵巢超聲波圖像; 2-4. Ⅲ期卵巢; 2-5. Ⅳ期卵巢超聲圖像; 2-6. Ⅳ期卵巢; 2-7. Ⅴ期卵巢超聲圖像; 2-8. Ⅴ期卵巢; Ovary. 卵巢; Ovum. 卵子; OC. 卵母細(xì)胞; N. 細(xì)胞核

2-1. Ultrasound image of ovary at phase II; 2-2. ovary at phase II; 2-3. ultrasound image of ovary at phase III; 2-4. ovary at phase III; 2-5. ultrasound image of ovary at phase IV; 2-6. ovary at phase IV; 2-7. ultrasound image of ovary at phaseV; 2-8. ovary at phaseV; OC. oocyte; N. nucleus

從上述超聲波圖像可得到, 不同發(fā)育階段的卵巢和精巢的超聲波圖像有比較明顯的差異: Ⅱ期和Ⅲ期卵巢的超聲波圖像呈小三角形, 結(jié)構(gòu)緊密; Ⅳ期和Ⅴ期卵巢的超聲波圖像呈白色亮點(diǎn)的圓形顆粒結(jié)構(gòu)。而Ⅳ期和Ⅴ期精巢的超聲波圖像則呈不規(guī)則黑影, 但Ⅱ期和Ⅲ期精巢的超聲波圖像無(wú)明顯的判別特征, 這兩個(gè)時(shí)期的精巢需要排除Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅴ期卵巢及Ⅳ期和Ⅴ期精巢來(lái)確定。

2.2 大西洋鮭性別及性腺發(fā)育期的鑒別結(jié)果

利用超聲成像技術(shù)鑒別雌魚(yú)的準(zhǔn)確率較雄魚(yú)高, 超聲成像技術(shù)正確鑒別出經(jīng)組織學(xué)觀察法驗(yàn)證的107 尾雌魚(yú)中的99 尾, 準(zhǔn)確率為93%; 在鑒別的166 尾雄魚(yú)中, 經(jīng)驗(yàn)證有135尾雄魚(yú), 準(zhǔn)確率為81%; 超聲成像技術(shù)共計(jì)鑒別273尾魚(yú), 正確鑒別出234尾, 雌雄平均準(zhǔn)確率達(dá)到86%(表1)。

超聲成像技術(shù)鑒別雌魚(yú)卵巢發(fā)育的準(zhǔn)確率隨卵巢的發(fā)育而提高, 而雄魚(yú)精巢發(fā)育的準(zhǔn)確率隨精巢的發(fā)育呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), 如表2所示: 此技術(shù)鑒別Ⅱ期+Ⅲ期、Ⅳ期卵巢的準(zhǔn)確率分別為87%、92%, 對(duì)Ⅴ期卵巢鑒別的準(zhǔn)確率達(dá)到100%。超聲成像技術(shù)鑒別Ⅱ期精巢的準(zhǔn)確率僅為64%, 對(duì)Ⅲ期、Ⅳ期精巢鑒別的準(zhǔn)確率分別為71%、86%, 精巢發(fā)育至Ⅴ期時(shí)的準(zhǔn)確率為84%。超聲成像技術(shù)鑒別雌雄性腺發(fā)育階段的平均準(zhǔn)確率為82%。超聲成像技術(shù)鑒別早期性腺(Ⅱ~Ⅲ期)發(fā)育的準(zhǔn)確率較低, 僅為75%; 對(duì)后期性腺(Ⅳ~(yú)Ⅴ期)發(fā)育鑒別的準(zhǔn)確率較高, 達(dá)到89%。

3-1. Ⅱ期精巢超聲波圖像; 3-2. Ⅱ期精巢; 3-3. Ⅲ期精巢超聲波圖像; 3-4. Ⅲ期精巢; 3-5. Ⅳ期精巢超聲波圖像; 3-6. Ⅳ期精巢; 3-7. Ⅴ期精巢超聲波圖像; 3-8. Ⅴ期精巢; Spermary. 精巢; SG. 精原細(xì)胞; SL. 精小葉; PSC. 初級(jí)精母細(xì)胞; SSC. 次級(jí)精母細(xì)胞; S. 精子

3-1. ultrasound image of spermary at phase II; 3-2. spermary at phase II; 3-3. ultrasound image of spermary at phase III; 3-4. spermary at phase III; 3-5. ultrasound image of spermary at phase IV; 3-6. spermary at phase IV; 3-7. ultrasound image of spermary at phase V; 3-8. spermary at phase V; SG. spermatogonia; SL. seminal lobule; PSC. primary spermatocytes; SSC. secondary spermatocytes; S. spermatozoa