魏志遠(yuǎn)，王　婷,2，徐　凱，許　磊，滕一鳴，蔡賢雷,2*

(1:溫州醫(yī)科大學(xué)浙江省流域水環(huán)境與健康風(fēng)險(xiǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325035)(2:浙南水科學(xué)研究院，溫州 325035)

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平原河網(wǎng)水體氮污染對(duì)氮循環(huán)菌的影響*

魏志遠(yuǎn)1，王婷1,2，徐凱1，許磊1，滕一鳴1，蔡賢雷1,2*

(1:溫州醫(yī)科大學(xué)浙江省流域水環(huán)境與健康風(fēng)險(xiǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325035)(2:浙南水科學(xué)研究院，溫州 325035)

采用最大可能數(shù)法對(duì)平原河網(wǎng)地區(qū)不同氮污染程度河道水體中浮游、顆粒附著及底泥中的氨化、亞硝化、硝化和反硝化菌進(jìn)行測(cè)定，研究水體氮污染程度對(duì)氮循環(huán)菌不同種群的影響效應(yīng)及其分布特征. 結(jié)果表明，浮游、顆粒附著和底泥中亞硝化菌的豐度隨著水體氮污染程度的增加而升高，但不同氮污染程度下氮循環(huán)菌種群結(jié)構(gòu)組成之間差異不大，而浮游、顆粒附著及底泥生活類型之間的氮循環(huán)菌種群結(jié)構(gòu)組成存在較大差異，其中浮游與底泥中氮循環(huán)菌種群組成結(jié)構(gòu)之間差異最大. 在氮污染水體中，浮游、顆粒附著和底泥氮循環(huán)菌中均以氨化菌為優(yōu)勢(shì)種群，顯著高出其他氮循環(huán)菌種群多個(gè)數(shù)量級(jí)，而亞硝化菌和硝化菌豐度相對(duì)較低，反硝化菌在水體懸浮顆粒物上存在相對(duì)較高的豐度，不同氮循環(huán)菌種群組成比例存在失衡現(xiàn)象.

氨化細(xì)菌；亞硝化細(xì)菌；硝化細(xì)菌；反硝化細(xì)菌；氮污染；平原河網(wǎng);最大可能數(shù)法

平原河網(wǎng)地區(qū)由于其特殊的地理位置和自然條件，通常人口稠密，近年來隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和城市化進(jìn)程的加快，河網(wǎng)水體納污量不斷增加，使得大量的氮素進(jìn)入水體，從而破壞了原有的氮平衡體系，導(dǎo)致水體的氮污染加劇，尤其是氨氮，已成為引起平原河網(wǎng)水體水質(zhì)超標(biāo)的主要污染物. 在水生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布著個(gè)體微小、營(yíng)養(yǎng)類型多樣、種類繁多、代謝極為活躍的各類微生物[1]. 相關(guān)研究表明，微生物數(shù)量或生物量隨水環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)程度的遞增而增加[2]. 因此，在平原河網(wǎng)這種嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化、大型水生生物消亡的水環(huán)境中，微生物所扮演的角色及發(fā)揮的生態(tài)效應(yīng)將會(huì)顯得尤為重要. 作為水生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分[3-4]，微生物在有機(jī)物的降解、生源要素的形態(tài)轉(zhuǎn)化和地球化學(xué)循環(huán)等方面發(fā)揮著舉足輕重的作用[5]，其中，自然界中氮的生物地球化學(xué)循環(huán)主要由微生物驅(qū)動(dòng). 在富營(yíng)養(yǎng)水生生態(tài)系統(tǒng)中，氮循環(huán)菌對(duì)氮素的遷移和轉(zhuǎn)化起著至關(guān)重要的作用，其相應(yīng)的理論研究與實(shí)際應(yīng)用均極為重要. 因此，對(duì)平原河網(wǎng)氮污染水體中的氮循環(huán)菌開展相關(guān)研究，不僅可以深化對(duì)平原河網(wǎng)中氮轉(zhuǎn)化機(jī)理及轉(zhuǎn)化效應(yīng)的認(rèn)識(shí)，而且可為河道氮污染的控制、修復(fù)及管理提供支撐.

溫瑞塘河是溫州市人口、經(jīng)濟(jì)和污染的聚集地，為典型的南方平原河網(wǎng)，河床比降小，流速緩慢，其水系河道貫穿溫州地區(qū)的鹿城、甌海、龍灣、瑞安“三區(qū)一市”，其河道總長(zhǎng)度為1178.4 km，其中主河道長(zhǎng)33.8 km，隨著當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)和城市建設(shè)的快速發(fā)展，各種生活污水和工業(yè)廢水不斷進(jìn)入河網(wǎng)，導(dǎo)致其水環(huán)境污染問題日益突出[6-9]. 同時(shí)，由于溫瑞塘河相對(duì)靜止的狀態(tài)，在其水系內(nèi)創(chuàng)造了許多獨(dú)特且相對(duì)穩(wěn)定的生境，為相關(guān)水環(huán)境的原位實(shí)驗(yàn)提供了良好條件. 因此，本研究以溫瑞塘河不同氮污染程度的河道為研究對(duì)象，對(duì)其中浮游、顆粒附著及底泥中的氮循環(huán)菌開展研究，揭示平原河網(wǎng)水體氮污染程度對(duì)氮循環(huán)菌的影響效應(yīng)，探討氮污染水體中氮的遷移、轉(zhuǎn)化規(guī)律，為平原河網(wǎng)地區(qū)氮污染水體的生態(tài)修復(fù)和可持續(xù)管理提供理論參考.

1 材料與方法

圖1 研究點(diǎn)位示意Fig.1 Location of study sites

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)區(qū)域(27°55′N,120°42′E)設(shè)立在浙江省溫州市溫瑞塘河茶山段舜岙河和橫江河上，位于溫州醫(yī)科大學(xué)茶山校區(qū)附近依據(jù)河道不同氮污染程度及水質(zhì)狀況，篩選3條河道設(shè)置研究點(diǎn)位，分別標(biāo)記為A1、A2和A3(圖1). 實(shí)驗(yàn)期間，不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域的水質(zhì)情況見表1，水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定方法參照《湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范》進(jìn)行[10]. 分別于2014年10月14日、11月8日、12月2日及12月22日，用采水器和彼得森采泥器(開口面積為0.0625 m2)分別采集表層水樣和表層底泥樣品，用保溫箱冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室做后續(xù)處理. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)參照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，以河道中不同氮污染程度為處理因素、以采樣時(shí)間作為區(qū)組，對(duì)水體中不同生活方式的氮循環(huán)菌影響效應(yīng)進(jìn)行研究.

1.2 指標(biāo)測(cè)定

采用最大可能數(shù)法(most probable number, MPN)對(duì)不同河道水體中的浮游、顆粒附著及底泥中氮循環(huán)菌進(jìn)行測(cè)定. 參照文獻(xiàn)[11-12]的膜過濾方法，經(jīng)孔徑為5 μm聚碳酸酯膜過濾，截留在濾膜上的微生物為顆粒附著微生物，并用與過濾體積相同的滅菌水對(duì)截留的顆粒物進(jìn)行振蕩懸浮混勻，用于顆粒附著氮循環(huán)菌的測(cè)定；而孔徑為5 μm聚碳酸酯膜過濾后的濾液用于浮游氮循環(huán)菌的測(cè)定；取底泥10 g，置于含90 ml滅菌水的錐形瓶中，振蕩混勻，即得稀釋10倍的底泥樣品，用于底泥中氮循環(huán)菌的測(cè)定，在將底泥樣品與其他樣品進(jìn)行比較時(shí)，視1 g為1 ml.

同時(shí)，分別配置氨化、亞硝化、硝化及反硝化菌培養(yǎng)液[13]，分裝于試管中，每支9 ml，并在反硝化培養(yǎng)液中倒置小玻璃管，加塞，在121℃下滅菌30 min. 每個(gè)樣品作5～7個(gè)10倍系列稀釋，每支試管各接種樣品和稀釋樣品1 ml，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)平行. 在28±1℃下暗處進(jìn)行培養(yǎng)，氨化細(xì)菌培養(yǎng)7 d，反硝化細(xì)菌培養(yǎng)15 d，亞硝化和硝化細(xì)菌均培養(yǎng)30 d. 以納氏試劑、格利斯試劑、二苯胺試劑等對(duì)各種形態(tài)氮的產(chǎn)生和消失情況進(jìn)行檢測(cè)，并定期觀察倒置小玻璃管中的產(chǎn)氣情況. 通過查MPN表及相應(yīng)的稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品中各種氮循環(huán)菌的數(shù)量.

表1 實(shí)驗(yàn)期間研究點(diǎn)位的水環(huán)境狀況

同一行上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；*表示P<0.05; **表示P<0.01; ***表示P<0.001.

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重對(duì)比，采用Sigmaplot 12.0軟件進(jìn)行作圖，采用PAST軟件的相似性分析(Analysis of similarity, ANOSIM)模塊對(duì)不同氮污染程度下氮循環(huán)菌種群結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)行定量比較. ANOSIM是一種比較不同群落差異顯著性的非參數(shù)檢驗(yàn)方法[14]，在本實(shí)驗(yàn)中，將數(shù)據(jù)經(jīng)過百分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)換后，以Bray-Curtis指數(shù)為相似性度量參數(shù)，顯著性以10000次重復(fù)取樣的排列群組算法進(jìn)行計(jì)算. 通過比較ANOSIM產(chǎn)生的R值(R值的大小表示不同群落的分離程度，1表示完全分離，即兩個(gè)群落沒有任何相似性，0表示兩個(gè)群落完全相同，沒有分離)對(duì)氮循環(huán)菌組成結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 水體氮污染程度對(duì)浮游氮循環(huán)菌的影響

由不同氮污染程度下浮游氮循環(huán)菌的豐度變化可知，在氮污染情況下，氮循環(huán)菌中的氨化菌豐度顯著高于其他氮循環(huán)菌多個(gè)數(shù)量級(jí). 浮游態(tài)亞硝化菌和反硝化菌的豐度隨水體氮污染程度的增加而升高；而硝化菌的豐度出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，其豐度與亞硝化菌相比，差距逐漸增大(圖2a).

2.2 水體氮污染程度對(duì)顆粒附著氮循環(huán)菌的影響

由不同氮污染程度下顆粒附著氮循環(huán)菌的豐度變化可知(圖2b)，在氮污染情況下，顆粒附著氮循環(huán)菌中的氨化菌在豐度上依舊具有明顯優(yōu)勢(shì)，與浮游態(tài)相比，顆粒附著氮循環(huán)菌中的反硝化菌具有相對(duì)較高的豐度. 另外，隨著氮污染程度的升高，亞硝化菌和硝化菌豐度逐漸升高，而反硝化菌豐度則逐漸降低.

2.3 水體氮污染程度對(duì)底泥中氮循環(huán)菌的影響

由不同氮污染程度下底泥中氮循環(huán)菌的豐度變化(圖2c)可知，在不同的氮污染區(qū)域，氮循環(huán)菌中的氨化菌豐度都最高，顯著高出其他氮循環(huán)菌多個(gè)數(shù)量級(jí). 隨著氮污染程度的增加，底泥氮循環(huán)菌中的氨化菌和亞硝化菌豐度有所增加，但4類氮循環(huán)菌的組成比例情況變化不大，均呈現(xiàn)出高豐度的氨化菌和低豐度的硝化菌的組成情況，并隨氮污染程度的升高亞硝化菌與硝化菌豐度之間的差距逐漸增大.

圖2 不同氮污染程度對(duì)浮游氮循環(huán)菌(a)、顆粒附著氮循環(huán)菌(b)和底泥中氮循環(huán)菌(c)豐度的影響Fig.2 Effects of aquatic nitrogen pollution on the planktonic nitrogen cycling bacteria(a),particleattached nitrogen cycling bacteria(b)and benthic nitrogen cycling bacteria(c)

2.4 不同氮污染程度、不同生活類型氮循環(huán)菌組成結(jié)構(gòu)的相似性分析

為了能夠更好地判斷不同氮污染程度、不同生活類型氮循環(huán)菌在組成結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)的變化，對(duì)氮循環(huán)菌的組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性分析(ANOSIM)，結(jié)果可知，氮循環(huán)菌組成結(jié)構(gòu)在不同氮污染程度之間的差異不顯著. A1與A2點(diǎn)位、A1與A3點(diǎn)位以及A2與A3點(diǎn)位R值分別為-0.01678、-0.02499以及-0.02331(P>0.05). 而在不同生活類型之間差異相對(duì)較大，浮游與顆粒附著氮循環(huán)菌之間(R=0.1099,P<0.05)、底泥與顆粒附著氮循環(huán)菌之間(R=0.1138,P<0.05)統(tǒng)計(jì)分析均達(dá)顯著水平，而浮游與底泥氮循環(huán)菌之間(R=0.2028,P<0.01)統(tǒng)計(jì)分析達(dá)極顯著水平. 通過對(duì)各生活類型之間分別進(jìn)行比較可以看出，浮游與底泥中氮循環(huán)菌之間的R值大于底泥與顆粒附著氮循環(huán)菌之間的R值，而浮游與顆粒附著氮循環(huán)菌之間的R值相對(duì)最小，說明氮循環(huán)菌組成結(jié)構(gòu)在浮游與底泥之間差異最大.

3 討論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和城市化進(jìn)程的加快，生活生產(chǎn)污水中大量的含氮物質(zhì)被排入城市河道，造成平原河網(wǎng)地區(qū)水環(huán)境的嚴(yán)重污染. 受污染的河水不僅會(huì)失去資源功能和使用價(jià)值，而且會(huì)嚴(yán)重破壞周圍景觀，甚至危害人類的身體健康. 水體中不同形態(tài)氮之間的轉(zhuǎn)化主要依賴于水生態(tài)中大量的氮循環(huán)微生物. 這些在水環(huán)境中廣泛分布、代謝活躍的氮循環(huán)微生物，對(duì)平原河網(wǎng)水生態(tài)的平衡、過量氮素的遷移轉(zhuǎn)化發(fā)揮著積極地作用. 然而，作為氮循環(huán)的直接參與者，這些氮循環(huán)微生物的群落特征和功能作用也會(huì)受到包括氮素形態(tài)、濃度在內(nèi)的多種環(huán)境因子的影響[15]. 本文研究結(jié)果顯示，高氮污染的河流水環(huán)境中氮循環(huán)菌呈現(xiàn)出一些與其他環(huán)境不一樣的分布特征. 首先，氨化菌的豐度顯著高于其他氮循環(huán)菌，而亞硝化菌和硝化菌豐度相對(duì)較低，組成比例失衡(圖2). 這應(yīng)該是由于氨化菌以有機(jī)氮為底物，通常在有機(jī)物較多的環(huán)境中生長(zhǎng)較好[16-18]. 而平原河網(wǎng)水體受到沿岸生活、餐廚污物的影響較大，有機(jī)物匯入較多，水體氮濃度高，溶解氧濃度普遍偏低，在研究中總氮濃度最低的A1點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)期間其平均總氮濃度也在21.00±4.15 mg/L(表1)，這為氨化菌的生存提供了充足的底物和適宜的生存環(huán)境，這可能是本研究結(jié)果中氨化菌豐度相對(duì)較高的原因. 而亞硝化菌和硝化菌為化能自養(yǎng)菌，當(dāng)氨化菌等異養(yǎng)菌利用有機(jī)物快速增殖時(shí)，對(duì)亞硝化菌和硝化菌會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，使其生長(zhǎng)受到限制[19-20]，這可能是亞硝化菌和硝化菌豐度較低的原因之一，也有可能正是因?yàn)閬喯趸拖趸S度顯著低于氨化菌進(jìn)而導(dǎo)致水體中氨態(tài)氮得不到有效轉(zhuǎn)化，使研究水域出現(xiàn)高氨態(tài)氮濃度的情況.

另外，對(duì)比亞硝化菌與硝化菌，發(fā)現(xiàn)亞硝化菌豐度普遍高于硝化菌(圖2). 相關(guān)研究表明在自然水體中游離氨對(duì)亞硝化菌、硝化菌存在抑制作用，作用濃度范圍分別為10～150 mg/L和0.1～1.0 mg/L，可見硝化菌對(duì)游離氨更為敏感[21]. 同時(shí)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，亞硝化菌的溶解氧飽和常數(shù)一般為0.2～0.4 mg/L，而硝化菌的溶解氧飽和常數(shù)一般為1.2～1.5 mg/L，在低溶解氧條件下亞硝化菌對(duì)溶解氧的親和力大于硝化菌[22]. 相應(yīng)的，在楊旭楠等的研究結(jié)果中便出現(xiàn)在低氧的河流沉積物中亞硝化菌豐度高于硝化菌的情況[23]. 因此，在高氮污染的水體中游離氨的存在及低濃度的溶解氧可能是導(dǎo)致亞硝化菌豐度普遍高于硝化菌的原因. 而隨著水體氮污染程度的增加，溶解氧濃度的降低，相應(yīng)的會(huì)更有利于亞硝化菌而不利于硝化菌的生長(zhǎng)，這可能是實(shí)驗(yàn)中隨著氮污染程度的增加亞硝化菌和硝化菌豐度差異逐漸增大的原因.

通過對(duì)不同氮污染程度、不同生活類型氮循環(huán)菌組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)不同氮污染程度之間氮循環(huán)菌在組成結(jié)構(gòu)上均較為相似，而不同生活類型之間差別相對(duì)較大，并均達(dá)到顯著性水平. 水體中微生物生理類群的數(shù)量往往與相應(yīng)化合物的濃度密切相關(guān)，但在本研究中不同污染程度區(qū)域之間氮濃度雖然存在顯著差異，但這種差異可能不及不同生活類型的氮循環(huán)菌所處的微環(huán)境差別之大，即使在氮濃度如此之高的水環(huán)境中，底泥與水體之間的差異依舊是不同研究區(qū)域之間所不能比擬的，這可能是導(dǎo)致不同生活類型氮循環(huán)菌組成結(jié)構(gòu)差異相對(duì)較大的原因. 另外，與其他生活類型相比，在顆粒附著態(tài)中明顯出現(xiàn)了較高豐度的反硝化菌，這可能與顆粒微界面這一特殊環(huán)境存在聯(lián)系；而隨著氮污染程度的增加，顆粒附著反硝化菌的豐度出現(xiàn)下降，這可能與反硝化菌的底物硝態(tài)氮在研究水域中隨著總氮、氨態(tài)氮濃度的增加而出現(xiàn)降低存在聯(lián)系(表1).

不同生活類型的氮循環(huán)菌種群結(jié)構(gòu)組成存在較大差異，在懸浮顆粒物上反硝化菌存在相對(duì)較高的豐度. 而縱觀平原河網(wǎng)氮污染水體中氮循環(huán)菌豐度的分布可以發(fā)現(xiàn)，在氮循環(huán)菌中氨化菌為優(yōu)勢(shì)種群，而亞硝化菌和硝化菌豐度相對(duì)較低，不同生理類群氮循環(huán)菌組成比例失衡.

致謝：感謝洪宇軒、蔡芬芬、楊李君、嚴(yán)璐在實(shí)驗(yàn)中給予的幫助.

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Effects of aquatic nitrogen pollution on the nitrogen cycling bacteria in plain river network

WEI Zhiyuan1, WANG Ting1,2, XU Kai1, XU Lei1, TENG Yiming1& CAI Xianlei1,2**

(1:KeyLaboratoryofWatershedScienceandHealthofZhejiangProvince,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,P.R.China)(2:SouthernZhejiangWaterResearchInstitute,Wenzhou325035,P.R.China)

To explore the effects of aquatic nitrogen pollution on nitrogen cycling bacteria in plain river network, the abundances of planktonic, particle-attached and benthic nitrogen cycling bacteria (ammonifying bacteria, nitrosobacteria, nitrobacteria and denitrifying bacteria) were determined by the most probable number (MPN) method in three different study sites with different loads of nitrogen pollution. Although the abundance of nitrosobacteria increased with the nitrogen pollution loads, the nitrogen pollution loads had no significant effect on the relative proportions of nitrogen cycling bacteria. However, there were significant differences in the relative proportions of nitrogen cycling bacteria among the planktonic, particle-attached and benthic habitats. The greatest differences in the relative proportions of nitrogen cycling bacteria were found between the planktonic and benthic habitats. Furthermore, in the nitrogen polluted water bodies, the ammonifying bacteria were the dominant group, not only in the water, but also in the sediment. The abundance of ammonifying bacteria was significantly higher as compared to that of other nitrogen cycling bacteria, the abundances of nitrosobacteria and nitrobacteria were relatively lower, and the denitrifying bacteria were more abundant on the suspend particle than other habitats. These results suggested that the relative proportions of nitrogen cycling bacteria in the nitrogen pollution were unbalanced.

Ammonifying bacteria; nitrosobacteria; nitrobacteria; denitrifying bacteria; nitrogen pollution; plain river network； most probable number

*溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(S20140042, S20140041)和溫州醫(yī)科大學(xué)科研發(fā)展基金項(xiàng)目(QTJ13014)聯(lián)合資助. 2015-09-06收稿；2015-10-14收修改稿. 魏志遠(yuǎn)(1993～)，男,本科生；E-mail: weizhiyuzou@foxmail.com.

**通信作者；E-mail: caixl@wmu.edu.cn.