梁桂娟，王迎濤，劉艷紅，唐成和，關(guān)海山鄭州人民醫(yī)院新生兒科，河南鄭州45005；中國(guó)人民解放軍5醫(yī)院檢驗(yàn)中心，河南鄭州45004；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院新生兒科，河南新鄉(xiāng)4500

新生大鼠缺氧缺血性腦損傷TLR4表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

梁桂娟1，王迎濤2，劉艷紅1，唐成和3，關(guān)海山11鄭州人民醫(yī)院新生兒科，河南鄭州450053；2中國(guó)人民解放軍153醫(yī)院檢驗(yàn)中心，河南鄭州450042；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院新生兒科，河南新鄉(xiāng)453003

目的通過檢測(cè)TLR4在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）中表達(dá)變化，并與凋亡情況對(duì)比，研究TLR4在新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)制中的作用，為臨床的進(jìn)一步研究提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法選取80只7 d齡新生健康大鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各40只。TUNEL法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡狀況，免疫組化SP法檢測(cè)TLR4表達(dá)變化。結(jié)果細(xì)胞凋亡缺氧缺血術(shù)后6 h陽(yáng)性率上升，至24 h達(dá)到高峰，72 h和7 d表達(dá)下降。TlR4實(shí)驗(yàn)組于缺氧缺血6 h即出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，12 h表達(dá)到峰值，24 h無明顯變化，72 h和7 d表達(dá)下降。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TLR4與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)（r=0.452）。結(jié)論新生大鼠缺氧缺血性腦損傷組織中TLR4高表達(dá)，可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，在腦損害的形成過程中起到了重要的作用。

新生大鼠；缺氧缺血；腦損傷；TLR4；凋亡

新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）是由圍生期各種因素引起的部分或完全性缺氧，腦血流量減少或暫停而導(dǎo)致的胎兒和新生兒的腦損傷，多見于足月兒，導(dǎo)致不可逆的腦損傷，是新生兒死亡和繼發(fā)智力障礙、腦癱等傷殘的主要原因之一，新生兒HIE發(fā)病率為（1～80）/1000，在這其中10%～20%在新生兒期死亡，存活的25%～30%可能會(huì)留有遠(yuǎn)期神經(jīng)發(fā)育后遺癥，以致嚴(yán)重威脅新生兒的生命健康，給家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)，也使產(chǎn)科和兒科醫(yī)師面臨著極大的壓力［1］。缺氧是發(fā)病的核心，其中圍生期窒息是最主要病因已被廣泛接受［2-5］，它的發(fā)病機(jī)制、干預(yù)策略和影響遠(yuǎn)期預(yù)后的研究，一直是普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問題。近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病的基礎(chǔ)和臨床進(jìn)行了大量的研究，但目前仍未取得突破性進(jìn)展，臨床上也無特異的治療方法［6］。因此，致力于新生兒缺氧缺血性腦病的發(fā)病機(jī)制研究，有著非常重要的臨床意義。這次研究通過觀察TLR4在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型中表達(dá)變化，并與凋亡情況對(duì)比，探討其在新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)制中的作用，為新生兒缺氧缺血性腦病防治提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

研究對(duì)象選取80只健康新生7 d齡SD大鼠，無性別選擇，體質(zhì)量12～15 g，完全隨機(jī)方法分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各40只；再將2組大鼠隨機(jī)分為6、12、24、72 h、7 d組，每組8只，分別于大鼠足部貼上標(biāo)簽。

1.2方法與觀察指標(biāo)

參照Rice法［7］7日齡大鼠建立缺氧缺血性腦損傷模型，將實(shí)驗(yàn)組大鼠的左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，并置于8%O2+ 92%N2的氮氧混合器環(huán)境2 h，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。對(duì)照組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不予結(jié)扎和缺氧處理。分別于術(shù)后6、12、24、72 h和7 d對(duì)2組大鼠行心臟灌注，斷頭取腦制作成石蠟標(biāo)本，顯微鏡下觀察標(biāo)本變化情況，TUNEL法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡狀況，免疫組化SP法檢測(cè)TLR4表達(dá)變化；記錄2組大鼠的一般情況、體質(zhì)量、行為學(xué)變化等。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，全部結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體質(zhì)量、行為學(xué)改變及病理變化

實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組，有顯著差異。缺氧缺血后新生大鼠出現(xiàn)程度不等的行為變化，如躁動(dòng)不安、全身發(fā)紺、四肢強(qiáng)直抽動(dòng)。HE染色：缺氧缺血后6 h左側(cè)腦神經(jīng)細(xì)胞水腫和少量局灶性壞死；缺血缺氧后18～24 h，左側(cè)皮質(zhì)腦組織壞死面積逐漸增大，24～48 h可見大面積壞死。72 h可見界限清楚的壞死灶。

2.2細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率在腦損傷過程中的表達(dá)變化

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)率隨時(shí)間變化動(dòng)態(tài)變化，6 h開始表達(dá)，此后逐步上升，24 h達(dá)到峰值，3 d細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率下降。對(duì)照組細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在6、12、24、72 h、7 d 5個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。實(shí)驗(yàn)組12 h和24 h相比P＞0.05，其余實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較P＜0.05。在陰性對(duì)照?qǐng)D片中，未見陽(yáng)性細(xì)胞。

表1　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大腦皮質(zhì)區(qū)凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率比較（n=40，x±s）

2.3TLR4的表達(dá)變化

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組新生大鼠腦組織均可見TLR4的表達(dá)，對(duì)照組表達(dá)量少，且無明顯變化。實(shí)驗(yàn)組于缺氧缺血后6 h表達(dá)開始增加，12 h表達(dá)達(dá)到高峰，24 h無明顯變化，72 h和7 d表達(dá)下降，12 h和24 h組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余組間各時(shí)間點(diǎn)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.05，表2）。實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果存在顯著差異，實(shí)驗(yàn)組12 h和24 h相比P＞0.05，其余實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較P均＜0.05。

2.4TLR4表達(dá)水平與其細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析

表2　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大腦皮質(zhì)TLR4平均光密度（n=40±s）

表2　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大腦皮質(zhì)TLR4平均光密度（n=40±s）

*P＞0.05（實(shí)驗(yàn)組12 h vs實(shí)驗(yàn)組24 h）.

分組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t P 6 h 0.0111±0.0008 0.3271±0.0333* 26.86 ＜0.05 12 h 0.0105±0.0014 0.4359±0.0428* 28.127 ＜0.05 24 h 0.0114±0.0007 0.4342±0.0428* 27.945 ＜0.05 72 h 0.0105±0.0013 0.3005±0.0209* 38.974 ＜0.05 7 d 0.0112±0.0023 0.2744±0.0288* 25.73 ＜0.05

新生大鼠缺氧缺血后大腦皮質(zhì)內(nèi)TLR4與凋亡細(xì)胞的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.452，P＜0.01），即在一定時(shí)間內(nèi)（HIBD 24 h內(nèi)）隨TLR4表達(dá)的逐漸增多，凋亡細(xì)胞的表達(dá)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；在一定時(shí)間內(nèi)（HIBD 72 h后）隨TLR4表達(dá)的逐漸減少，凋亡細(xì)胞的表達(dá)也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

3　討論

新生兒缺氧缺血性腦病發(fā)病率為0.2%～0.4%，是新生兒期最常見的腦損傷。重者致患兒死亡，部分可遺留智力低下、腦癱及癲癇等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損害［8］。1995年首次應(yīng)用HE染色和DNA電泳方法，在實(shí)驗(yàn)性HIBD模型鼠腦皮質(zhì)、海馬、丘腦證明新生大鼠單側(cè)腦缺血缺氧后，在腦組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有凋亡特異性的斷裂DNA出現(xiàn)［9］。此實(shí)驗(yàn)顯示缺氧缺血后6 h可見凋亡細(xì)胞，12 h明顯增多，24 h達(dá)到高峰，72 h凋亡指數(shù)下降，與對(duì)照組比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異，與此次實(shí)驗(yàn)蘇木精-伊紅染色所示病理改變的嚴(yán)重程度相對(duì)應(yīng)，這就提示細(xì)胞凋亡可能是新生大鼠腦損傷的重要機(jī)制之一。

有研究表明促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要因素之一，可加重缺氧缺血性腦細(xì)胞的損傷［10-11］，TLRs作為固有免疫反應(yīng)關(guān)鍵的模式識(shí)別受體之一，在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生中有著重要作用［12］。其中，TLR4主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)［13］。當(dāng)缺氧缺血腦損傷釋放大量?jī)?nèi)源性激活物，TLR4能誘導(dǎo)MyD88依賴和TRIF依賴的兩個(gè)信號(hào)通路，從而觸發(fā)一系列級(jí)聯(lián)免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控［14］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：TLR4實(shí)驗(yàn)組在缺血6 h表達(dá)逐漸增強(qiáng)，24 h達(dá)到峰值后下降，3～7 d較假手術(shù)組仍高表達(dá)，其表達(dá)規(guī)律與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相符［15］，提示TLR4作為炎性損傷因子，可能參與了缺氧缺血后腦損傷。且TLR4表達(dá)與細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰的時(shí)間一致，說明在新生兒缺血缺氧性腦病中由TLR4介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路的過度激活，可能引起大量與腦損傷密切相關(guān)的炎性介質(zhì)的釋放，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡加重腦組織損傷，這與Jung等［16］用革蘭陰性菌的脂多糖激活TLR4信號(hào)通路刺激試管內(nèi)培養(yǎng)的鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的結(jié)果相符，提示TLR4與細(xì)胞凋亡之間可能存在關(guān)聯(lián)。因此HIBD后通過阻斷TLR4，可能早期阻斷凋亡的發(fā)生，從而預(yù)防HIBD的發(fā)生。

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The correlation between TLR4 expression and apoptosis of hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats

LIANG Guijuan1，WANG Yingtao2，LIU Yanhong1，TANG Chenghe3，GUAN Haishan11Department of Neonatology，The People's Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450053，China；2Laboratory Center of the PLA No.153 Hospital，Zhengzhou 450042，China；3Department of Neonatology，The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China

Objective To investigate the role of TLR4 in HIBD by observing the change of TLR4 expression and cell apoptosis after hypoxic-ischemic brain damage（HIBD）in a neonatal rat model，and provide an experimental foundation for the futher clinical research.Methods A total of 80 7day postnatal Sprague-Dawley rats were randomly divided into experimental group （n=40）and control group（n=40）.The expression of TLR4 was tested by immunohistochemistry，the apoptotic hippocampus cells were tested by TUNEL.Results The cell apoptosis and the expression of TLR4 increased at HI 6 h，and achieved the hightest increases at HI 12 h，and it continued to maintain the high level in HI 24 h，then decreased at HI 72 h、HI7 d group.There were significant differences of positive rate at different times compared with control group（P＜0.05）.There was a positive correlation between apoptosis and TLR4（r=0.452）in rats with hypoxic-ischemic brain damage.Conclusion TLR4 over expressed in HIBD can promote cell apoptosis，and play an important role in the pathogenesis of HIBD.

neonatal rats；hypoxia-ischemia；brain damage；TLR4；apoptosis

2016-02-01

梁桂娟，E-mail:liangguijuan2008@163.com

唐成和，E-mail:tchexer@126.com