李鵬程，劉玉玲，黨群，劉慧麗，王冬亮，湯福想，郭沛沛，劉學(xué)友

（1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

論著

雌激素受體α、雌激素受體β、激活蛋白1、血管內(nèi)皮生長因子在大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型中的表達及意義*

李鵬程1，劉玉玲1，黨群2，劉慧麗2，王冬亮1，湯福想1，郭沛沛1，劉學(xué)友1

（1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

目的探討雌激素受體α（ERα）、雌激素受體β（ERβ）、激活蛋白1（AP-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在大鼠子宮內(nèi)膜異位癥（EM s）模型中的表達及意義。方法采用皮下種植法建立大鼠EM s模型，選取建模成功的28只大鼠為模型組（n=28），觀察大鼠EMs模型在位內(nèi)膜及異位病灶的組織病理學(xué)改變，并通過免疫組織化學(xué)法檢測對照組子宮內(nèi)膜、模型組在位子宮內(nèi)膜和異位病灶ERα、ERβ、AP-1、VEGF的表達情況。結(jié)果①大鼠EM s模型在位內(nèi)膜及異位病灶腺體、間質(zhì)血管明顯增加；②大鼠EMs模型的異位病灶與對照組子宮內(nèi)膜間ERα陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.107），而其在位內(nèi)膜中的表達較對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。ERβ、AP-1（c-jun）蛋白、VEGF在模型組在位內(nèi)膜及異位病灶中陽性率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但其在位內(nèi)膜及異位病灶中的表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論大鼠EM s模型在位內(nèi)膜中ERα和ERβ均高表達，異位病灶中則僅表現(xiàn)為ERβ高表達，同時上調(diào)c-jun，VEGF的表達，ERβ可能在EM s的發(fā)生發(fā)展中起到較ERα更為重要的作用。

子宮內(nèi)膜異位癥；動物模型；雌激素受體亞型；激活蛋白1

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）是一種雌激素依賴性疾病，嚴重影響育齡期婦女的生活質(zhì)量及生育能力。關(guān)于其發(fā)病機制，SAMPSON最先提出經(jīng)血逆流學(xué)說，而后郎景和院士提出“在位內(nèi)膜決定論”[1]認為EMs的在位子宮內(nèi)膜與非子宮內(nèi)膜異位癥存在本質(zhì)上的不同。其分子生物學(xué)行為可能源于雌激素暴露，作用于雌激素受體（estrogen receptor，ER），啟動對應(yīng)的信號通路，多條信號通路相互作用的結(jié)果促進了逆流的子宮內(nèi)膜在宮腔以外生長。激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程，雌激素與ER結(jié)合后，依賴ER轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子（如AP-1、NF-кB）的活性，進而調(diào)控相應(yīng)細胞因子的表達，促進EMs的形成和發(fā)展。大量研究證據(jù)顯示，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在EMs的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，但與有關(guān)信號傳導(dǎo)途徑的研究結(jié)果尚不明確。本研究通過建立大鼠EMs模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測正常大鼠子宮內(nèi)膜、大鼠EMs模型異位病灶及在位子宮內(nèi)膜中ERα，ERβ，AP-1（c-jun蛋白）、VEGF的表達，探討雌激素受體亞型、AP-1、VEGF在大鼠EMs模型中的表達特點及意義。

1　材料與方法

1.1材料來源

河南省動物實驗中心購買的清潔健康雌性未孕的SD大鼠60只。鼠齡60～90 d，體重220～250 g，實驗的各研究組大鼠的鼠齡、質(zhì)量之間均無明顯差異。兔抗大鼠ER α、ER β、c-jun、VEGF多克隆抗體，免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建大鼠EM s模型觀察大鼠的正常發(fā)情周期，選取連續(xù)觀察2個正常發(fā)情周期的大鼠進行建模。建模前1天均肌注苯甲酸雌二醇0.2mg/（kg· d），使大鼠處于發(fā)情期，皮下移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥的動物模型[2]。具體方法：供體大鼠稱重，10%水合氯醛（0.3ml/100 g）腹腔麻醉，固定，常規(guī)腹部備皮，消毒鋪巾，取尿道口上方大概10mm處行約3 cm的垂直正中縱切口開腹進入腹腔，在膀胱下可見子宮呈“Y”形，近端在離宮角約10mm處結(jié)扎，遠端在離卵巢約20mm處結(jié)扎，切除子宮，放入磷酸鹽緩沖液中洗滌，切開管形子宮，剝除漿膜層、肌層，將剝除的子宮內(nèi)膜剪為5mm×5mm大小的片段；采用皮下種植法將子宮內(nèi)膜片段植入受體大鼠的腹肌和皮下筋膜之間，使內(nèi)膜面緊貼腹肌進行皮下建模術(shù)，同時取部分內(nèi)膜組織送病理檢查以確認為大鼠子宮內(nèi)膜組織，最后關(guān)腹。術(shù)后3 d常規(guī)進行硫酸慶大霉素0.1ml肌肉注射預(yù)防感染。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)3周，進行2次開腹，觀察移植子宮內(nèi)膜（異位病灶）的生長情況。構(gòu)建模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：病理組織學(xué)證明為大鼠子宮內(nèi)膜組織，移植物呈囊性生長增大，囊壁有新鮮血管形成、少許結(jié)締組織，囊泡內(nèi)有清亮或黃色液體。

1.2.2實驗分組及標(biāo)本處理隨機選取同一批次10只正常雌性大鼠作為對照組（喂養(yǎng)條件與術(shù)后實驗組相同），選取建模成功的大鼠28只（2只為無效造模）作為實驗組，在消毒、無菌條件下取模型組大鼠異位病灶組織、在位子宮內(nèi)膜及對照組子宮內(nèi)膜，分別固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，將蠟塊連續(xù)切片，厚4μm，部分常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，部分用免疫組織化學(xué)法檢測ER α，ER β，AP-1（c-jun蛋白）、VEGF的表達情況。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果判定采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素 -生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法，本實驗中用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗，呈陰性，嚴格按照試劑盒操作說明進行，脫蠟、滅活內(nèi)源性酶、封閉，一抗、二抗反應(yīng)后二氨基聯(lián)苯胺顯色并脫水后鑲埋，充分干燥后采用半定量標(biāo)準(zhǔn)判定免疫組織化學(xué)的陽性結(jié)果：每個石蠟標(biāo)本取4張切片，每張切片鏡下隨機取5個（×400）視野，綜合染色強度及細胞核中陽性細胞的百分比進行判定，抗體效應(yīng)物為棕褐色或棕黃色。陽性細胞染色深度評分標(biāo)準(zhǔn)：淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞所占比例評分標(biāo)準(zhǔn)：1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；兩者乘積≥3分為陽性，各組所有視野的平均分作為最終的評定標(biāo)準(zhǔn)，計算各組的陽性率。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用百分比或率表示，用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠EMs組織病理學(xué)特征

大鼠EMs模型異位病灶呈囊性生長增大，囊壁有新鮮血管形成、少許結(jié)締組織，囊泡內(nèi)有清亮或黃色液體。組織病理學(xué)可見異位子宮內(nèi)膜腺體生長良好，分散排列，囊腔可見炎癥細胞，間質(zhì)富含血管，固有腺體較多，呈擴張狀改變。腺體數(shù)目較在位內(nèi)膜少。見圖1。（異位病灶鏡下見較多脂肪組織因皮下建模的緣故）。

2.2對照組、模型組在位子宮內(nèi)膜及異位病灶中ER α、ER β、c-jun、VEGF蛋白的表達

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示ER α、ER β、c-jun、VEGF在大鼠子宮腺上皮細胞、腔上皮細胞及間質(zhì)細胞內(nèi)均有表達，其中以腺上皮細胞表達顯著，陽性表達呈棕色顆粒。整體來說ER α比ER β表現(xiàn)出更明顯的陽性率，均表現(xiàn)為棕褐色或棕黃色顆粒。ER α在模型組在位子宮內(nèi)膜中的表達及ER β、c-jun、VEGF在在位子宮內(nèi)膜和異位病灶中的表達均較對照組明顯增強（P<0.01），但ER α在異位病灶中的表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05），各因子在模型組異位病灶及在位子宮內(nèi)膜間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2～5和表1～4。

圖1　建模成功的大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶及在位內(nèi)膜的組織病理學(xué)特征（HE×100）

圖2　ER α在各研究組中的表達（SABC×400）

圖3　ER β在各研究組中的表達（SABC×400）

圖4　c-jun在各研究組中的表達（SABC×400）

圖5　VEGF在各研究組中的表達（SABC×400）

表1　ER α蛋白在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達情況

表2　ER β蛋白在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達情況

表3　c-jun蛋白在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達情況

表4　VEGF蛋白在兩組大鼠子宮內(nèi)膜中的表達情況

3　討論

3.1ER α、ER β與EMs的相關(guān)性

EMs是一種雌激素依賴性疾病，雌激素與ER結(jié)合促進了異位內(nèi)膜的侵襲、生長，且造成子宮內(nèi)膜細胞特殊的生物學(xué)性質(zhì)，郎景和院士提出“在位內(nèi)膜決定論”[1]，認為EMs的在位子宮內(nèi)膜具有更強的侵襲、黏附、血管形成特性，與正常子宮內(nèi)膜有明顯差異，可隨經(jīng)血逆流入腹腔并極易種植生長，引起EMs的發(fā)生發(fā)展。

隨著ERβ的發(fā)現(xiàn)，證明雌激素是通過ER α、ER β發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[3]，本研究中模型組在位內(nèi)膜中ERα、ERβ的表達均較對照組顯著，異位病灶中ERα的表達未表現(xiàn)出差異，ERβ的表達模型組較對照組顯著，驗證了“在位內(nèi)膜決定論”。模型組異位病灶ERβ的表達顯著，ER α/ER β比值降低，這與HUDELIST等[4]研究結(jié)果一致，異位病灶中ERβ的表達明顯增強，ERα的表達相對較弱。有報道ERα在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜中表達顯著，認為其是卵巢子宮內(nèi)膜異位癥形成和發(fā)展的關(guān)鍵[5]，而另有報道異位病灶中ERα的周期性改變不明顯，甚至消失，ERβ的改變在異位病灶中起主要作用[6-7]，本研究證實，在正常子宮內(nèi)膜、EMs在位子宮內(nèi)膜及異位病灶中ERα的表達較ERβ強，但只有EMs在位內(nèi)膜與對照組的比較中ERα的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其余未顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而ERβ在EMs的異位病灶和在位內(nèi)膜中表達明顯增強，據(jù)此推測，ERα是EMs發(fā)生的重要前提條件，ERβ決定EMs發(fā)生的結(jié)局，在位內(nèi)膜ERα、ERβ的顯著表達、異位病灶ERα/ERβ比值的下降，這種表達模式的改變，是促進EMs發(fā)生、發(fā)展的重要條件，ERβ在EMs的發(fā)生、發(fā)展中可能起到較ERα更為重要的作用，但是ERα、ERβ間是否存在相互作用以及其復(fù)雜的作用機制需要更深入的研究。

3.2ERα、ERβ與AP-1、VEGF的相互作用關(guān)系

雌激素作用于ER，通過ER信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對AP-1進行激活、調(diào)控。ER信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有兩種：①基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)；②非基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)：雌激素與ER結(jié)合后，主要依賴絲裂原激活蛋白激酶信號傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（NF-кB、AP-1等）的表達。高雌激素環(huán)境、ER的亞型、組織細胞的類型對AP-1的表達起著重要的作用，與EMs的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8]。VEGF在EMs中過表達，促進血管生成、異位內(nèi)膜細胞增殖，促進子宮內(nèi)膜細胞黏附、侵襲、血管形成。雌激素作用于ER，VEGF的表達明顯增強[9]，同時發(fā)現(xiàn)其啟動子內(nèi)包含AP-1的結(jié)合位點[10]，AP-1被激活后，作用于VEGF的轉(zhuǎn)錄位點，增強VEGF的表達。本實驗中在位內(nèi)膜ERα、ERβ的顯著表達、異位病灶ERα/ERβ比值的下降，AP-1的異常激活，VEGF的顯著上調(diào)，提示雌激素可能主要作用于ERβ，激活、調(diào)控AP-1，上調(diào)VEGF，促進EMs的發(fā)生、發(fā)展。但具體哪一種雌激素作用通路對AP-1進行調(diào)控，上調(diào)VEGF，需要進一步研究證實。另外ERβ、c-jun、VEGF在大鼠EMs模型的在位內(nèi)膜和異位病灶子宮內(nèi)膜的無差異表達，也更證實“在位內(nèi)膜決定論”的觀點。

綜上所述：EMs的發(fā)病機制尚在研究中，存在頗多爭議，雌激素受體表達模式的改變是EMs形成的一個重要方面。目前第3代雌激素受體調(diào)節(jié)劑巴多昔芬作為治療EMs的新藥逐漸進入人們的視野[2]，對ERα、ERβ及其作用通路及ERα、ERβ間復(fù)雜的作用機制進行研究，將為EMs的發(fā)病機制及臨床靶向治療提供理論依據(jù)。

[1]郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的“在位內(nèi)膜決定論”.中華醫(yī)學(xué)會.第八次全國婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C].中華醫(yī)學(xué)會,2004:2.

[2]呂會娟,劉玉玲,黨群,等.巴多昔芬對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的作用及機制[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2015(4):291-295.

[3]KUIPER GG,ENMARK E,PELTO-HUIKKO M,et al.Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(12):5925-5930.

[4]HUDELIST G,KECKSTEIN J,CZERWENKA K,et al.Estrogen receptor beta and matrix metalloproteinase 1 are coexpressed in uterine endometrium and endometriotic lesions of patients with endometriosis[J].Fertil Steril,2005,84(2):1249-1256.

[5]MATSUZAKI S,FUKAYA T,UEHARA S,et al.Characterization of messenger RNA expression of estrogen receptor-alpha and-beta in patients with ovarian endometriosis[J].Fertil Steril,2000, 73(6):1219-1225.

[6]FUJIMOTO J,HIROSE R,SAKAGUCHI H,et al.Expression of oestrogen receptor-alpha and-beta in ovarian endometriomata[J]. Mol Hum Reprod,1999,5(8):742-747.

[7]FAZLEABAS A T,BRUDNEY A,CHAI D,et al.Steroid receptor and aromatase expression in baboon endometriotic lesions[J]. Fertil Steril,2003,80(2):820-827.

[8]PAECH K,WEBB P,KUIPER G G,et al.Differential ligand activation of estrogen receptors ERalpha and ERbeta at AP1 sites[J]. Science,1997,277(5331):1508-1510.

[9]HYDER SM,NAWAZ Z,CHIAPPETTA C,et al.Identification of functional estrogen response elements in the gene coding for the potent angiogenic factor vascular endothelial growth factor[J]. Cancer Res,2000,60(12):3183-3190.

[10]MARCONCINI L,MARCHIO S,MORBIDELLI L,et al.c-fosinduced growth factor/vascular endothelial growth factor D induces angiogenesis in vivo and in vitro[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(17):9671-9676.

（張蕾編輯）

Expression and significance of estrogen receptors α and β，activator protein and VEGF in rat model of endometriosis*

Peng-cheng Li1，Yu-ling Liu1，Qun Dang2，Hui-li Liu2，Dong-liang Wang1，F(xiàn)u-xiang Tang1，Pei-pei Guo1，Xue-you Liu1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450014，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou，Henan 450003，China）

Objective To explore the expression and significance of estrogen receptor α（ERα），ER β，activator protein 1（AP-1）and VEGF in rat model of endometriosis（EM）.M ethods Subcutaneous implantation was used to establish EM model in female rats.The rats with successful ectopic implants were served as model group（n=28），and the normal rats served as control group（n=10）.The histopathological changes of ectopic implants were observed after fourweeks.The expression levels of ERα，ERβ，AP-1 and VEGF in the endometrium and endometriosis lesions were observed by immunohistochemistry in the two groups.Results There were more glands and blood vessels in the stroma of endometriosis lesions and the endometrium of the model group.There was no statistically significant difference in ER α expression level between the endometriosis lesions of the EM model and the endometrium of the control group（P=0.107），but its expression level in the endometrium of the model group was obviously increased compared with the control group（P＜0.01）.The expression levels of ERβ，AP-1 and VEGF inthe endometriosis lesions and endometrium of the EM model were obviously increased compared with those of the control group（P＜0.01），but there was no statistically significant difference between the endometriosis lesions and endometrium of the EM model.Conclusions ER α and ER β are obviously increased in the endometrium of the EM rat model；but in the endometriosis lesions，only ER β is significantly increased.Moreover，the expressions of AP-1 and VEGF are up-regulated in the EM model.ER β may play a more important role than ER α in the occurrence of endometriosis.

endometriosis；animal model；estrogen receptor subtype；activator protein 1

R-332；R711.71

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.002

1005-8982（2016）14-0007-05

2016-04-06

河南省衛(wèi)生科技中青年創(chuàng)新人才工程資助項目（No：201004122）

劉玉玲，E-mail：zzlyl63@163.com