陳宇薇，趙曉華，黃鵬

[1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院（廣州市惠愛醫(yī)院）精神科，廣東 廣州 510370；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515]

論著

枸杞多糖對(duì)精神分裂癥模型大鼠海馬中G luR1表達(dá)及認(rèn)知功能的影響

陳宇薇1，趙曉華2，黃鵬1

[1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院（廣州市惠愛醫(yī)院）精神科，廣東 廣州 510370；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515]

目的探討枸杞多糖（LBP）對(duì)精神分裂癥模型（Sz）大鼠海馬中G luR 1表達(dá)及認(rèn)知功能影響。 方法選取36只健康SD大鼠，隨機(jī)分3組，每組12只，分別為正常對(duì)照組、模型組及藥物干預(yù)組（Sz+LBP）。Sz及Sz+LBP腹腔注射地卓西平馬來酸鹽0.6mg/（kg·d），連續(xù)注射14 d制造精神分裂癥模型，Sz+LBP同時(shí)灌胃枸杞多糖100mg/（kg·d）。正常對(duì)照組在相應(yīng)時(shí)段注射等劑量的正常生理鹽水。造模成功后，分別評(píng)估各組大鼠的行為學(xué)改變，進(jìn)行M orris水迷宮，比較3組大鼠的定位航行和空間探索時(shí)間以及采用免疫熒光染色、W estern blot法測(cè)定海馬中GluR 1蛋白的表達(dá)。結(jié)果Sz的運(yùn)動(dòng)量、共濟(jì)失調(diào)、刻板行為評(píng)分以及海馬中GluR 1均高于正常對(duì)照組（P<0.01），Sz+LBP的運(yùn)動(dòng)量、共濟(jì)失調(diào)及刻板行為評(píng)分均低于Sz，明顯抑制精神分裂癥大鼠海馬中GluR1的表達(dá)（P<0.01）。結(jié)論枸杞多糖對(duì)精神分裂癥模型大鼠海馬具有保護(hù)作用，其機(jī)制與海馬中GluR 1表達(dá)來改善其認(rèn)知功能相關(guān)。

枸杞多糖；精神分裂癥；海馬；GluR 1；認(rèn)知功能。

精神分裂癥是一種嚴(yán)重危害人群健康且認(rèn)知缺陷發(fā)生率非常高的重性精神病之一[1-2]。精神分裂癥給患者和社會(huì)帶來了嚴(yán)重的困擾，其原因是對(duì)其病因和發(fā)病機(jī)制的研究尚未明確。對(duì)于精神分裂癥的假說眾說紛紜，其中精神分裂癥谷氨酸（Glutamate，Glu）功能紊亂假說最為流行，認(rèn)為精神分裂癥患者N-甲基 -D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體缺陷誘導(dǎo)的Glu系統(tǒng)功能紊亂是精神分裂癥的主要病理機(jī)制。并且研究發(fā)現(xiàn)給予動(dòng)物NMDA受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑或非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，均可引起與精神分裂癥（Schizophrenia，Sz）類似的異常行為[3-4]。枸杞多糖（lycium barbarrum polysaccharides，LBP）從枸杞子中提取出來的，是中藥枸杞子的重要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)LBP具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化以及延緩衰老等多種功效，尤其是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有非常重要的保護(hù)功能[5]。本研究旨在通過建立地卓西平馬來酸鹽（Dizocilpine，MK-801）誘導(dǎo)的精神分裂癥模型，探討枸杞多糖對(duì)海馬的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療精神分裂癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物

選取鼠齡為8周（體重220～240 g）的健康雄性SD大鼠36只，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫為（20±2）℃，濕度為43%～45%，常規(guī)的自由攝食飲水，將動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品與試劑

枸杞多糖購(gòu)自廣州廣修堂醫(yī)藥科技有限公司，含量≥30%，MK-801購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，兔抗大鼠Anti-谷氨酸受體1（glutamate receptor 1，GluR1）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的建立

健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組（Sz）和藥物干預(yù)組（Sz+LBP），每組各12只。模型組（Sz）和藥物干預(yù)組（Sz+LBP）腹腔注射MK-801 0.6mg/（kg·d）[6]連續(xù)注射14 d；同時(shí)藥物干預(yù)組灌胃給予枸杞多糖100mg/（kg·d）正常組以等容量生理鹽水同時(shí)注射。

1.4運(yùn)動(dòng)量的評(píng)價(jià)

飼養(yǎng)14 d后，監(jiān)測(cè)給藥以后各組大鼠60min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)量的差異。具體方法：將各組大鼠放入監(jiān)測(cè)室里透明的塑料盒內(nèi)（規(guī)則35 cm×35 cm×25 cm），適應(yīng)環(huán)境30min后注射給藥（MK-801）。每只大鼠每5min的運(yùn)動(dòng)情況將自動(dòng)記錄保存在計(jì)算機(jī)上。

1.5評(píng)估刻板行為和共濟(jì)失調(diào)程度

參考SAMS-DODD[7]的刻板行為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，采用的是5級(jí)評(píng)分，進(jìn)行盲法評(píng)分，取其平均分，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。評(píng)分越高，說明精神分裂癥癥狀越重。參考HOFFMAN[8]的共濟(jì)失調(diào)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，共濟(jì)失調(diào)本研究用4級(jí)評(píng)分，每10min評(píng)分1次。進(jìn)行盲法評(píng)分，取其平均分，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。進(jìn)行盲法評(píng)分，取其平均分，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。評(píng)分越高，說明精神分裂癥癥狀越重。

1.6Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

在（30±2）℃水池內(nèi)各組大鼠自停藥后第l天實(shí)施水迷宮實(shí)驗(yàn)，由計(jì)算機(jī)監(jiān)視系統(tǒng)同步記錄各組大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。①定位航行實(shí)驗(yàn)：造模后一共測(cè)試3 d，每天測(cè)試6次大鼠尋找平臺(tái)的學(xué)習(xí)能力的檢測(cè)。每天上午8︰00～12︰00對(duì)各組大鼠進(jìn)行訓(xùn)練和測(cè)試，具體方法：將平的站臺(tái)放在水池的中央，隨機(jī)從4個(gè)象限標(biāo)記好的入水點(diǎn)將大鼠面向池壁慢慢地放入水中，電腦軟件將記錄大鼠搜索站臺(tái)軌跡，從大鼠入水游泳直到找到并爬上平臺(tái)所游過的距離。記錄在平臺(tái)象限內(nèi)的游泳時(shí)間，共4次，取平均值。②空間探索實(shí)驗(yàn)：撤走池內(nèi)平臺(tái)，將大鼠從原入水點(diǎn)面向池壁放入池中。計(jì)算機(jī)將記錄大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)和在平臺(tái)象限內(nèi)的游泳時(shí)間用于測(cè)試大鼠的空間記憶能力，共4次，取平均值。

1.7蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)通過Western blot實(shí)驗(yàn)方法對(duì)海馬不同區(qū)域組織的GluR1表達(dá)量進(jìn)行比較。大鼠在末次游泳實(shí)驗(yàn)后30min迅速斷頭處死，取出腦組織。游離右側(cè)海馬，放置-80℃冰箱保存，具體方法：①4℃將海馬區(qū)切片，裂解分離CA1區(qū)組織，然后經(jīng)勻漿液離心，提取CA1區(qū)總蛋白，接著離心總蛋白，最后超聲波裂解，從裂解液中分離提取生物化蛋白；②組織勻漿后提取蛋白成分變性，蛋白樣品通過聚丙烯酰胺凝膠（積層膠濃度6%，分離膠濃度10%）電泳2 h，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上（濕轉(zhuǎn)300ma，1.5 h或110 V，1 h）；③轉(zhuǎn)膜后，將膜置于3%牛血清白蛋白溶液中孵育；④加一抗Anti-GluR1抗體（1∶1 000），孵育（4℃，過夜），TBST洗一抗；⑤加二抗HRP抗體（1∶1 000）孵育（室溫，40min），TBST洗二抗，發(fā)光。采用NIH ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析。采用軟件Imagine分析圖像灰度，檢測(cè)各組樣品中海馬CA1區(qū)突觸膜上GluR1的表達(dá)量，后續(xù)統(tǒng)計(jì)。

1.8免疫熒光染色

心臟灌流法采集腦組織標(biāo)本。切片的厚度為18μm，貼于掛膠的載玻片，置于-80℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)前，將切片置于室溫放置1 h，具體方法：①0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶液沖洗3次，每次3min；②0.2%Triton-X100 37℃孵育30min，PBS沖洗；③加一抗（1∶100），4℃冰箱過夜；④PBS沖洗，加入熒光標(biāo)記的二抗（1∶100），放入37℃恒溫箱溫育1 h，PBS沖洗。滴加熒光封片劑，封片。熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍攝，利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3組間差異比較首先采用方差分析，在有意義的基礎(chǔ)之上，兩組間差異比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1運(yùn)動(dòng)量的評(píng)價(jià)

將正常對(duì)照組，模型組，藥物干預(yù)組大鼠60min內(nèi)運(yùn)動(dòng)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：3個(gè)比較組行方差分析，可見差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；行兩兩比較發(fā)現(xiàn)模型組均高于對(duì)照組，LBP組大鼠低于模型組。見表1。

2.2刻板行為和共濟(jì)失調(diào)評(píng)估

結(jié)果顯示：刻板行為和共濟(jì)失調(diào)評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組高于正常對(duì)照組。共濟(jì)失調(diào)程度呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)。見表2、表3。

2.3海馬G luR1的表達(dá)

如圖1所示，正常對(duì)照組海馬GluR1的表達(dá)量為0.453，模型組為0.782，藥物干預(yù)組為0.569。

表1　各組大鼠運(yùn)動(dòng)量的評(píng)價(jià) （）

表1　各組大鼠運(yùn)動(dòng)量的評(píng)價(jià) （）

注：1）與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-57.204，P=0.032）；2）給藥之后，與模型組比較癥狀有所改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=30.454，P=0.025）

?

表2　大鼠刻板行為的變化（n=36，分，）

表2　大鼠刻板行為的變化（n=36，分，）

注：1）與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-11.361，P=0.047）；2）給藥之后，與模型組比較癥狀有所改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.055，P=0.032）

結(jié)果正常對(duì)照組　0.73±1.12模型組　4.78±2.341）藥物干預(yù)組　2.53±0.562）F值　25.86 P值　0.039組別

表3　大鼠共濟(jì)失調(diào)的變化（n=18，分，）

表3　大鼠共濟(jì)失調(diào)的變化（n=18，分，）

注：1）與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-10.129，P=0.021）；2）給藥之后，與模型組比較癥狀有所改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.201，P=0.008）

結(jié)果正常對(duì)照組　0.43±0.13模型組　2.03±0.781）藥物干預(yù)組　1.23±0.522）F值　36.79 P值　0.028組別

圖1　海馬GluR1的表達(dá)

2.4海馬G luR1陽性神經(jīng)元的表達(dá)

正常對(duì)照組海馬GluR陽性神經(jīng)元的表達(dá)量為19.000，模型組為43.000，藥物干預(yù)組為35.000。見圖2。

圖2　海馬G luR陽性神經(jīng)元的表達(dá)

3　討論

精神分裂癥是一種較常見的精神疾病，涉及思維、情感和行為等多方面的障礙，以精神活動(dòng)與環(huán)境不脅凋?yàn)樘卣鱗9-10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)在精神分裂癥患者中認(rèn)知缺陷的發(fā)生率高，約85%患者出現(xiàn)認(rèn)知功能方面的障礙[11]。臨床上使用的藥物在治療過程中易出現(xiàn)不良反應(yīng)和鎮(zhèn)靜、體位性低血壓與植物神經(jīng)紊亂的不良反應(yīng)。因此，探索尋找療效好、副作用小的抗精神分裂癥的中草藥非常迫切，目前我國(guó)國(guó)內(nèi)尚未有人具體探討中藥治療精神分裂癥的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。因此，對(duì)于建立合理的動(dòng)物模型，選取合理的藥物干預(yù)并對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究非常有意義。本文利用dizocilpine（MK-801）是高親和力的NMDA受體非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，制備精神分裂癥模型，探討精神分裂癥對(duì)認(rèn)知功能的影響。

本研究連續(xù)14 d給大鼠腹腔注射MK-801，監(jiān)測(cè)各組大鼠的運(yùn)動(dòng)量的變化和精神狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠行為活動(dòng)均正常，而模型組大鼠均出現(xiàn)持續(xù)、無目的、迅速的追尾運(yùn)動(dòng)。枸杞多糖干預(yù)組大鼠活動(dòng)明顯有所改善（表1、表2）。此結(jié)果與ANDINE等[12]給藥誘發(fā)大鼠精神分裂癥發(fā)生后的行為學(xué)改變一致。此外，模型組大鼠還出現(xiàn)擬精神分裂癥癥狀如：向一邊傾斜、走路不穩(wěn)、反復(fù)跌倒、重復(fù)抬頭、搖頭或旋轉(zhuǎn)、尖叫等。筆者對(duì)各組大鼠的異常行進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的共濟(jì)失調(diào)與刻板行為評(píng)分均高于正常對(duì)照組，此結(jié)果與YAMAGUCHI[13]相關(guān)研究結(jié)果一致。證明MK-801誘導(dǎo)產(chǎn)生類似精神分裂癥的模型非常成功。枸杞多糖干預(yù)后，上述癥狀均有所改善。說明枸杞多糖對(duì)精神分裂癥有一定的治療作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸受體包括α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受體和NMDA受體。其中AMPA受體的數(shù)量決定了突出后神經(jīng)元興奮的程度，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響突觸傳遞的主要決定因素.它在突觸后膜區(qū)和突觸后膜外區(qū)存在的數(shù)量比的穩(wěn)定性，并在學(xué)習(xí)與記憶功能中發(fā)揮重要作用，對(duì)于大腦信息的儲(chǔ)存是具有非常重要的意義[14-15]。GluR1是AMPA受體最主要的受體，因此研究其在精神分裂癥模型中的機(jī)制尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥模型大鼠海馬區(qū)GluR1的表達(dá)量較正常組明顯增加，枸杞多糖干預(yù)后，精神分裂癥大鼠海馬區(qū)及CA1區(qū)突觸膜蛋白中GluR1的表達(dá)量降低。因此認(rèn)為L(zhǎng)BP對(duì)認(rèn)知的保護(hù)作用可能與CA1區(qū)突觸膜上GluR1表達(dá)量的較少有關(guān)。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)主要通過選取枸杞多糖為干預(yù)藥物，建立合理的精神分裂癥大鼠模型，探討枸杞多糖對(duì)精神分裂癥認(rèn)知功能的影響及其作用機(jī)制，為精神分裂癥的臨床藥物治療提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并對(duì)精神分裂癥治療提供了新靶點(diǎn)。即枸杞多糖能夠保護(hù)精神分裂癥大鼠的認(rèn)知功能，其具體機(jī)制可能與GluR1在海馬區(qū)總蛋白及海馬CA1區(qū)突觸膜蛋白中的表達(dá)量有關(guān)。

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（張西倩編輯）

Effect of Lycium barbarrum polysaccharides on hippocam pal GluR1 and cognitive function of schizophrenia rats

Yu-wei Chen1,Xiao-hua Zhao2,Peng Huang1
［1.Department of Psychiatry，the Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University，（Guangzhou Huiai Hospital），Guangzhou，Guangdong 510370，China；2.Traditional Chinese Medical College of Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China］

Objective To exp lore the effect of Lycium barbarrum polysaccharides（LBP）on receptor 1 of glutamic acid（GluR1）in hippocampus and cognitive function of schizophrenia rats.Methods Thirty-six SD rats were randomly divided into 3 groups with 12 in each group：normal group，model group and LBP group.Model group and LBP group were given MK801（0.6mg/kg·d）with sinistro-intraperitoneal injection to set the schizophrenia model.At the same time，LBP group was administered intragatrically with 100 mg/kg·d LBP.The control group was injected with 0.9%saline（NS）in the corresponding period.The behavioral changes of each ratwere separately assessed with Morris experiment，and the navigation and time space exploration were compared between the three groups.Using immunofluorescence and Western blot，the GluR1 protein expression in hippocampus was determined.Results The model group had higher amount of exercise，ataxia，stereotyped behavior score and GluR1 expression in hippocampus than the control group（P＜0.01）.LBP group had significantly lower amount of exercise，ataxia，stereotyped behavior score and GluR1 expression in hippocampus than the model group（P＜0.01）.ConclusionsLBP plays a protective role for schizophrenia，its mechanism may be due to down-regulation of GluR1 expression in the hippocampus of schizophrenia rats.

Lycium barbarrum polysaccharide；schizophrenia；hippocampus；glutamate receptor 1；cognitive function

R 749

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.004

1005-8982（2016）14-0017-05

2016-03-27