楊耿斌　劉興焱　何長(zhǎng)安　紀(jì)春學(xué)　王　輝　張　恒

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，克山 161606）

黑龍江省北部七縣市玉米大斑病菌小種鑒定

楊耿斌劉興焱何長(zhǎng)安紀(jì)春學(xué)王輝張恒

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，克山 161606）

玉米大斑病的發(fā)生流行常對(duì)玉米生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，而該病的發(fā)生與病原菌生理小種變異密切相關(guān)，新生理小種的出現(xiàn)往往導(dǎo)致生產(chǎn)上玉米品種抗性喪失。為此，在玉米主產(chǎn)地及時(shí)準(zhǔn)確地調(diào)查該地區(qū)大斑病菌的小種變異，對(duì)指導(dǎo)抗病育種和抗病品種的生產(chǎn)推廣有重要意義。本研究從黑龍江省第三、第四積溫帶玉米產(chǎn)區(qū)的7個(gè)縣市中采集病害標(biāo)樣，通過(guò)組織分離獲得了21個(gè)玉米大斑病菌菌株。經(jīng)采用玉米大斑病菌生理小種鑒別寄主接種鑒定，發(fā)現(xiàn)在上述區(qū)域內(nèi)僅有13N 和23N 2個(gè)生理小種，小種構(gòu)成較為簡(jiǎn)單，并且以13N號(hào)小種為主。

玉米；大斑??；生理小種；鑒定

玉米大斑病（NCLB，Northern corn leaf blight）是春播玉米生產(chǎn)的主要病害之一。大斑病主要危害玉米的葉片，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)也侵染玉米的葉鞘和苞葉，在一般流行年份造成玉米減產(chǎn)20%左右。黑龍江省是玉米大斑病重發(fā)區(qū)，該病害長(zhǎng)期威脅著黑龍江省玉米的安全生產(chǎn)，特別是在20世紀(jì)80年代后的多次大流行，對(duì)玉米生產(chǎn)帶來(lái)極大危害［1］。玉米大斑病的發(fā)生也會(huì)加重玉米莖腐病等病害的發(fā)生和危害，進(jìn)一步影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)［2］。近年，玉米大斑病發(fā)生危害呈現(xiàn)明顯加重趨勢(shì)，尤其是在我國(guó)西南春玉米區(qū)和東北春玉米區(qū)已經(jīng)給當(dāng)?shù)赜衩咨a(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失［3］，2012年以來(lái)在黑龍江省再度流行。

李春霞等［4］對(duì)黑龍江省多地采集的玉米大斑病葉標(biāo)本100余份進(jìn)行病菌分離鑒定，結(jié)果表明黑龍江中南部玉米產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢(shì)小種為0號(hào)小種，另外還存在1號(hào)生理小種。紀(jì)偉波等［5］用常規(guī)鑒別寄主鑒定采自黑龍江省玉米主產(chǎn)區(qū)的48個(gè)大斑病菌菌株，鑒定出0、1、12、13、23N、123共6個(gè)生理小種，但以0號(hào)生理小種為主，其他小種有上升為優(yōu)勢(shì)小種的趨勢(shì)。在黑龍江北部地區(qū)，隨著玉米生產(chǎn)的發(fā)展，大斑病也由輕趨重，逐漸成為重要的生產(chǎn)問(wèn)題，亟需在生產(chǎn)中推廣抗病品種以控制大斑病的流行。因此，理清黑龍江省早熟玉米區(qū)大斑病菌生理小種的現(xiàn)狀及其分布情況，對(duì)指導(dǎo)該區(qū)域的抗病品種選育及品種合理推廣有著重要的意義。

1　材料與方法

1.1大斑病菌分離物來(lái)源2012年從黑龍江省早熟玉米區(qū)的7個(gè)縣市采集并分離病菌，并對(duì)采集地生產(chǎn)田大斑病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，共獲得21份分離物（表1），純化后分離物保存至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基斜面試管中待用。

1.2供試鑒別寄主采用含有Ht1、Ht2、Ht3和HtN單抗性基因的一套鑒別寄主，分別為A619、A619Ht1、Pa91Ht2、Pa91Ht3、A632HtN，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所王曉鳴研究員提供。鑒別寄主種子在25℃的種子發(fā)芽箱中催芽48h，將萌動(dòng)后的種子播種于直徑30cm的花盆內(nèi)，每盆播種5粒，待幼苗長(zhǎng)至3葉時(shí)每盆保留3株，4葉期時(shí)分別接種待鑒定的病菌菌株。

1.3生理小種鑒定將純化后的大斑病菌接種在PDA培養(yǎng)基平板中，25℃下培養(yǎng)2周后再轉(zhuǎn)至高粱粒上培養(yǎng)2周，產(chǎn)孢后待用。接種前將每個(gè)菌株配置成濃度約為10萬(wàn)個(gè)/mL孢子的接種液，加入數(shù)滴0.1%吐溫20，振蕩搖勻后接種。采用噴霧接種并將攜帶病菌孢子的高粱粒撒施在玉米心葉中，以保證接種效果。每個(gè)菌株接種5盆（15株），接種后的植株保濕24h，然后轉(zhuǎn)入正常管理。

在接種2周后進(jìn)行葉片病斑反應(yīng)類(lèi)型調(diào)查。R反應(yīng)型：初期病斑為褐色窄條形壞死斑或黃綠色水浸狀條斑，之后逐漸病斑中間變成褐色，邊緣多有黃色暈圈，病斑出現(xiàn)早，枯死慢，不產(chǎn)生孢子或很少產(chǎn)生孢子。S反應(yīng)型：初期病斑為灰綠色水浸狀斑，后擴(kuò)展為梭形大斑，中間明顯壞死，病斑呈灰褐色，邊緣無(wú)明顯暈圈，病斑出現(xiàn)晚，枯死快，圍繞病斑周?chē)忻黠@的萎蔫區(qū)，溫濕度適宜時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量褐色霉層。

1.4病菌生理小種命名玉米大斑病菌生理小種命名采用Thakurr等［6］提出的命名系統(tǒng)，并參照劉國(guó)勝等［7］的新命名法。

表1　黑龍江省北部七縣市玉米大斑病病菌分離物采集地點(diǎn)

1.5玉米品種田間對(duì)大斑病抗性評(píng)價(jià)在9月上旬對(duì)田間玉米品種對(duì)大斑病的抗病性進(jìn)行調(diào)查，參照表2的病級(jí)指標(biāo)體系，結(jié)合全株葉片發(fā)病情況，進(jìn)行玉米品種抗大斑病水平的評(píng)價(jià)。

表2　玉米品種抗大斑病病情級(jí)別劃分及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2　結(jié)果與分析

2.1大斑病病樣采集區(qū)玉米品種的田間抗病性表現(xiàn)2012年在采集玉米大斑病病葉的同時(shí)，對(duì)采集地生產(chǎn)田不同品種的大斑病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查。

表3　2012年大斑病采集地玉米品種對(duì)大斑病的田間抗病性

2012年共對(duì)7個(gè)縣（市）的玉米大斑病葉采集區(qū)的生產(chǎn)品種田間大斑病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查（表3），涉及9個(gè)品種，其中克山縣、訥河市、慶安縣玉米大斑病發(fā)生程度較輕，病情級(jí)別為1級(jí)；鶴崗市穗位下部葉片上有少量病斑，病斑占葉片面積＜10%，穗位上部葉片只有零星病斑，病情級(jí)別為1～3級(jí)；鐵力市玉米大斑病的發(fā)生因品種的不同發(fā)病程度差別較大，其中綏玉7玉米大斑病發(fā)生較輕，在穗位以下葉片上只有零星病斑出現(xiàn)，病斑占葉片面積＜5%，病情級(jí)別為1級(jí)，而德美亞1號(hào)穗位上部有少量病斑，穗位下部葉片上有較多病斑，病斑占葉片面積的20%～30%，病情級(jí)別為5級(jí)；拜泉縣玉米大斑病發(fā)生程度較相臨的克山縣略重，不同玉米品種間發(fā)生也不盡相同，其中吉單519穗位下部葉片上有少量病斑出現(xiàn)，病斑占葉片面積＜10%，穗位上部葉片只有零星病斑，病情級(jí)別為1～3級(jí)，而鑫鑫1號(hào)玉米大斑病發(fā)生程度重于吉單519，不同地塊有一定差異，整體上病斑占葉片面積＜30%，病情級(jí)別為3～5級(jí)；趙光農(nóng)場(chǎng)玉米大斑病發(fā)生程度較重，穗位下部葉片或穗位上部葉片上有大量病斑，病斑相連，占葉片面積的31%～70%，病情級(jí)別達(dá)到7級(jí)。

在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，相同品種在不同區(qū)域大斑病發(fā)病程度也有很大差異，鑫鑫1號(hào)在慶安縣大斑病發(fā)病較輕，病情級(jí)別為1級(jí)，而在拜泉縣穗位下部葉片上較多病斑，病斑占葉片面積＜30%，病情級(jí)別為3～5級(jí)；德美亞1號(hào)在鐵力市穗位上部葉片有少量病斑，穗位下部葉片上有較多病斑，病斑占葉片面積的20%～30%，病情級(jí)別為5級(jí)，而在趙光農(nóng)場(chǎng)大斑病發(fā)生程度較重，穗位下部及穗位上部葉片上有大量病斑，病斑相連，占葉片面積的31%～70%，病情級(jí)別達(dá)到7級(jí)。

2.2玉米大斑病菌生理小種鑒定及分布特征對(duì)2012年采自克山、訥河、慶安等7個(gè)縣市玉米大斑病病菌分離物進(jìn)行生理小種鑒定，各分離物在鑒別寄主上反應(yīng)型分為2類(lèi)（表4）。在21個(gè)分離物中鑒別出2個(gè)生理小種，分別為13N和23N。13N號(hào)生理小種占測(cè)定分離物的66.7%，為優(yōu)勢(shì)小種。

表4　21個(gè)大斑病菌分離物在鑒別寄主上的反應(yīng)及生理小種劃分

鑒定結(jié)果顯示，13N號(hào)生理小種分布于克山、拜泉、訥河、鐵力、趙光農(nóng)場(chǎng)，而23N號(hào)生理小種主要分布于慶安和鶴崗，且拜泉有1個(gè)分離物。2個(gè)生理小種有較明顯的分布區(qū)域，其中地理位置偏北的地區(qū)（克山、拜泉、訥河、趙光農(nóng)場(chǎng)）基本為13N小種流行區(qū)，而在3個(gè)相對(duì)地理位置偏南的地方中，2個(gè)（慶安、鶴崗）為23N小種的流行區(qū)。

2.3小種毒性頻率分析生理小種測(cè)定結(jié)果表明，21株被測(cè)分離物對(duì)抗大斑病基因的毒性頻率在地區(qū)間存在差異。所有分離物對(duì)Ht3和HtN基因具有較強(qiáng)的致病性，毒性頻率為100%，表明這2個(gè)基因控制的對(duì)大斑病的抗病性在黑龍江北部地區(qū)無(wú)法有效利用；對(duì)Ht1抗性基因的毒性頻率居中，為66.7%；對(duì)Ht2抗性基因的毒性頻率最低，為33.3%，該抗性基因仍有較大的利用空間，但在慶安縣與鶴崗市是失效的。

3　討論

根據(jù)對(duì)采自黑龍江省北部地區(qū)的21份玉米大斑病菌分離物生理小種的鑒定結(jié)果，黑龍江省北部地區(qū)玉米大斑病菌小種組成較為簡(jiǎn)單，只存在2個(gè)生理小種，分別為13N和23N。13N號(hào)占測(cè)定菌株的66.7%。本試驗(yàn)中13N號(hào)生理小種為黑龍江省北部的優(yōu)勢(shì)小種。21株被測(cè)菌株中，Ht3和HtN基因的抗性完全喪失，毒性頻率為100%，對(duì)Ht1基因毒性頻率居中，而Ht2基因的抗性仍有發(fā)揮較大作用的空間。

我國(guó)玉米大斑病菌生理分化研究開(kāi)展于20世紀(jì)70年代。白金愷等［8］對(duì)我國(guó)21個(gè)玉米產(chǎn)區(qū)的玉米大斑病病菌樣本進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果只存在0號(hào)生理小種，表明我國(guó)70年代玉米大斑病生理小種比較單一。隨后，高金欣等［2］對(duì)采自于遼寧、吉林、黑龍江省28個(gè)玉米產(chǎn)區(qū)的玉米大斑病菌樣本進(jìn)行生理小種鑒定，共鑒定出0、1、2、3、N、12、13、1N、2N、123、12N和123N號(hào)12個(gè)生理小種，說(shuō)明玉米大斑病的發(fā)生隨著時(shí)間的增加生理小種組成趨于多元化。

石鳳梅等［9］對(duì)黑龍江省45份玉米大斑病病菌菌株的生理小種進(jìn)行鑒定，鑒定出6個(gè)生理小種，其中也包含23N號(hào)生理小種，說(shuō)明黑龍江省玉米大斑病的小種分化也是隨著年代的增加趨于復(fù)雜。本工作中新鑒定出13N號(hào)生理小種，而且成為采樣區(qū)域的優(yōu)勢(shì)小種，說(shuō)明黑龍江省玉米大斑病的小種分化一直在演變中。黑龍江北部區(qū)域玉米大規(guī)模種植的歷史較短，因此，大斑病也呈現(xiàn)隨著種植年限的增加而逐漸加重的趨勢(shì)，因此不能掉以輕心，要及時(shí)了解病菌的變異動(dòng)態(tài)和品種田間抗病性的變化，合理使用抗大斑病品種，避免大斑病的暴發(fā)流行。

［1］孫德全，李綏艷，林紅，等.黑龍江省玉米主要病害發(fā)生原因分析及抗病育種對(duì)策.作物雜志，2009（2）：90-93

［2］高金欣，呂淑霞，高增貴，等.東北地區(qū)2009年玉米大斑病菌生理小種鑒定與動(dòng)態(tài)分析.玉米科學(xué)，2011，19（3）：138-140

［3］王曉鳴，晉齊鳴，石潔，等.玉米病害發(fā)生現(xiàn)狀與推廣品種抗性對(duì)未來(lái)病害發(fā)展的影響.植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（1）：1-11

［4］李春霞，蘇俊，龔士深，等.黑龍江省中南部地區(qū)玉米大斑病菌生理小種變異的研究.玉米科學(xué)，2003，11（4）：80-81

［5］紀(jì)偉波，何海軍，趙松濤，等.黑龍江玉米大斑病菌生理分化研究.玉米科學(xué)，2010，18（1）：128-130

［6］ Thakurr P，Leonard K J，Jonksr K.Characterization of a new race of Exserohilum turcicum virulent on corn with resistance gene HtN.Plant Disease，1989，73：151-155

［7］劉國(guó)勝，董金皋，鄧福友.中國(guó)玉米大斑病菌生理分化及新命名法的初步研究.植物病理學(xué)報(bào)，1996，26（4）：305-310

［8］白金愷，潘順?lè)?，姜晶?玉米病害的病菌變異與抗病品種選育.玉米科學(xué)，1994，2（1）：67-72

［9］石鳳梅，馬立功.黑龍江省玉米大斑病菌小種生理分化的研究.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（2）：63-65

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02-42）

2016-05-30）