方春玉,周　健,明紅梅,趙興秀,陳蒙恩,姚　霞

(四川理工學(xué)院生物工程系,四川自貢 643000)

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投加高效聚磷菌P2的污泥馴化及其微生物群落變化的研究

方春玉,周健,明紅梅,趙興秀,陳蒙恩,姚霞

(四川理工學(xué)院生物工程系,四川自貢 643000)

將高效聚磷菌菌株P(guān)2擴大培養(yǎng)后投加到原有污泥當(dāng)中,通過CASS反應(yīng)器按照菌株P(guān)2的最佳除磷條件進行馴化,并對馴化過程中的相關(guān)污水排放指標(biāo)進行檢測,然后對污泥抗沖擊能力進行考察,研究其在不同溫度、時間、pH及反應(yīng)參數(shù)下的除磷能力,最后對原有污泥及馴化后污泥中微生物的總DNA進行提取,并利用PCR-DGGE變性梯度凝膠電泳技術(shù)對其微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明,當(dāng)馴化進行到15 d時,出水中磷酸鹽含量等各項指標(biāo)基本趨于穩(wěn)定,結(jié)束第一階段馴化。馴化系統(tǒng)適宜的pH7.0、適宜的溫度為35 ℃,運行中厭氧好氧交換的頻率以20 min為宜,且厭氧釋磷時間為1.5 h,此條件下,磷的去除率高達(dá)93.6%。在最佳馴化條件下,一些原本在群落中不占優(yōu)勢的聚磷類微生物如聚磷菌P2,經(jīng)過馴化后能更好適應(yīng)環(huán)境逐漸占據(jù)優(yōu)勢地位,活性污泥馴化前后群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化。

聚磷菌,污泥馴化,污泥微生物,微生物群落變化

含磷廢水中,聚磷菌是活性污泥除磷的主力軍,因此,要想提高活性污泥的除磷能力,就必須提高聚磷類微生物在活性污泥中所占的比例及除磷能力[1]?；钚晕勰嗟鸟Z化過程中,微生物群落變化直接反映出添加菌的適應(yīng)能力和適應(yīng)條件,這使得在實際的應(yīng)用中,污泥馴化及系統(tǒng)的處理能力變得極易控制。目前,不少研究者對廢水處理工藝和設(shè)備進行改進,以期提高廢水處理效率;也有人在采用生物強化手段,但污水處理系統(tǒng)中污泥活微生物量少、污泥活性低、處理能力弱、處理不穩(wěn)定[2-4]。本研究擬通過投加高效聚磷菌菌種,找到高效菌株的最佳適應(yīng)和代謝條件,探尋污泥馴化前后微生物群落的變化規(guī)律,以期提高含磷污水系統(tǒng)中磷元素的去除效率、增加污泥的抗沖擊能力,從而穩(wěn)定污水處理系統(tǒng)的處理能力。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種從瀘州老窖股份有限公司羅漢污水處理站CASS反應(yīng)池污泥中分離的菌株檸檬酸桿菌P2(Citrobactersp);本實驗所用的活性污泥取自瀘州老窖羅漢污水處理站CASS曝氣池;實驗用水取自羅漢污水處理站中間水池廢水添加一定量的化學(xué)試劑,添加比例及水質(zhì)特征見表1所示;營養(yǎng)培養(yǎng)基牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、KH2PO415 mg,蒸餾水至1000 mL、pH7.2～7.4。

表1　配制廢水成分及最終水質(zhì)特征Table 1　Composition and quality characteristics of configuration waste water

868型精密pH計熱電上海;ST16R恒溫高速離心機美國Thermo;CTL-12化學(xué)需氧量速測儀承德市華通;5B-6P總磷測定儀上海連華;55i+Ds-SM-U1生物顯微成像系統(tǒng)日本NIKON;SCAN1200影像分析菌落計數(shù)儀上海智理;C1000 PCR擴增儀美國BIORAD;721BRO3125凝膠成像儀美國BIORAD;374BR4168 DGGE電泳儀美國BIORAD;MODEL474 DGGE凝膠進樣器美國BIORAD;MILLI-Q超純水儀美國Millipore。

1.2實驗方法

1.2.1污泥馴化及相關(guān)條件控制馴化裝置為30 L的圓柱形玻璃容器,通過下方水浴鍋進行恒溫控制。將之前擴大培養(yǎng)后的高效聚磷菌P2按照1∶1量(體積比)投加到裝有污泥的馴化裝置中,用恒流泵從馴化裝置底部循環(huán)進水[5-7],并依據(jù)前期研究的聚磷菌最佳除磷生長條件研究結(jié)果,將污泥培養(yǎng)條件盡量接近聚磷菌最佳代謝條件,即P2的最佳除磷條件為時間10.51 h、初始COD濃度494.52 mg/L、初始pH7.0、初始TP 50 mg/L、溫度35 ℃,使其在活性污泥中占據(jù)一定比例,期間必然會引起整個群落結(jié)構(gòu)的變化,甚至?xí)斐苫钚晕勰嗾w除污能力的改變,馴化期間將溫度控制在35 ℃左右,pH調(diào)至7.3左右,馴化時間直至出水各指標(biāo)達(dá)到穩(wěn)定為止。

實驗采用靜止1.5 h、曝氣3.5 h、沉淀0.5 h后排水至設(shè)計排水高度(15 cm),后加相同水質(zhì)廢水至第一輪馴化的相同刻度,約25 L,進行下一輪馴化,這一馴化時間段每天對水樣除磷率、COD、MLSS等濃度進行測量,直至各參數(shù)基本保持穩(wěn)定,結(jié)束馴化。

1.2.2活性污泥除磷效果的研究對馴化后好氧活性污泥除磷性能及抗沖擊能力進行研究,主要考察溫度、pH、好氧/厭氧交替頻率及厭氧時間對活性污泥除磷效果的影響。

1.2.2.1pH的確定采取培養(yǎng)溫度為35 ℃,進水TP濃度為10 mg/L左右,厭氧時間為1.5 h,好氧時間為4 h,沉淀時間為0.5 h,其它條件不變的情況下,將進水pH分別控制為6、7、8、9,以考察不同pH下的除磷效果。

1.2.2.2溫度的確定由于在實際工藝當(dāng)中要處理的廢水量較大,且具有一定溫度(一般為35 ℃左右),又由于冬夏季氣溫變化較大,綜合實際情況,選擇溫度25、30、35、40 ℃進行實驗,其它實驗條件為厭氧時1.5 h,好氧3.5 h,沉淀0.5 h,進水pH為7,進水TP濃度為10 mg/L左右?？疾觳煌瑴囟认禄钚晕勰嗟某啄芰?。

1.2.2.3運行參數(shù)的確定反應(yīng)器運行參數(shù)的控制在于找出最佳除磷參數(shù),以便節(jié)約能源及時間,增加反應(yīng)器的利用率,主要為厭氧時間及厭氧好氧交替頻率的控制。按污泥馴化培養(yǎng)條件,改變不同的交替時間10、20、30 min,考察聚磷菌除磷效果。

本實驗選取厭氧時間分別為1、1.5、2 h,好氧時間為3.5 h,進水TP濃度為10 mg/L左右,溫度為35 ℃,pH7.0左右進行實驗。

1.2.3分析檢測方法COD利用COD快速測定儀測定;TP采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-89)測定;NH4-N采用氨氮測定儀直接測定；pH利用精密pH測定;MLSS、SVI采用量筒直接測量法;DNA的提取、DNA含量測定、電泳、染色等試劑的配制及操作參考文獻(xiàn)[8-15]。

1.2.4活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.2.4.1活性污泥中微生物總DNA提取和純化取原始污泥和馴化至出水穩(wěn)定后(15 d)的活性污泥液1 mL分別接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基中,于30 ℃、150 r/min的搖床內(nèi)過夜培養(yǎng),之后按照如下方法對活性污泥中混菌基因組總DNA進行提取。提取步驟為:菌體收集—輔助裂解— 除蛋白—抽提—離心—風(fēng)干[5-12]。

1.2.4.2DNA檢測利用核酸蛋白儀分別對馴化前后活性污泥中所提取的總DNA的OD260 nm/280 nm、OD260 nm/230 nm進行測定,從而確定所提取的活性污泥馴化前后菌落總DNA的含量及純度。

1.2.4.3PCR擴增以純化后的基因組DNA為模版進行PCR擴增,引物采用細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)的引物F341(5′ CCTACGGGAGGCAGCAG3′)和R518(5′ ATTACCGCGGCTGCTGG3′),其擴增體系見表2。

表2　PCR擴增體系Table 2　The system of PCR amplification

PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性94 ℃ 4 min、65 ℃ 40 s(退火)72 ℃ 40 s,1 min(返回至第二步,21個循環(huán),每個循環(huán)中退火溫度下降0.5 ℃)94 ℃、65 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s,1.5 min(返回至第五步,10個循環(huán))72 ℃、12 ℃ 10 min、4 ℃ 20 min暫停;通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增結(jié)果進行檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1污泥馴化

通過第一階段污泥馴化,直至各參數(shù)基本保持穩(wěn)定,結(jié)束馴化,每天對水樣TP去除率、COD、MLSS等濃度進行測量,結(jié)果見圖1。

圖1　馴化第一階段出水水質(zhì)變化情況Fig.1　The variation of quality characteristics of waste water during the first stage of sludge domestication

經(jīng)過15 d的馴化,出水中COD、除磷率及MLSS濃度等指標(biāo)基本趨于恒定,比較于初始指標(biāo),效果顯著(p<0.05),期間污泥由黑色逐漸變?yōu)楹稚?且沉降性能良好,MLSS穩(wěn)定在1000 mg/L左右,結(jié)果如圖2所示。

圖2　污泥馴化前后形態(tài)圖Fig.2　The shape of sludge acclimation before morphological 注:a馴化前,b馴化后。

從圖2可知,經(jīng)過一段時間的馴化,聚磷菌開始逐漸適應(yīng)環(huán)境而不斷增殖,這個周期性過程體現(xiàn)了厭氧釋磷和好氧吸磷的典型聚磷菌代謝特征,這一特征表明馴化污泥已經(jīng)具備較高除磷能力。經(jīng)過15 d的馴化,污水中出水TP濃度由開始的10.0 mg/L左右降至0.2 mg/L左右,磷的去除率由開始的不足20%逐漸上升并穩(wěn)定在95%以上,磷去除效果顯著(p<0.05),說明第一階段馴化已經(jīng)順利完成。從圖2可知,經(jīng)過15 d的馴化,污泥由剛開始的絮凝態(tài)逐步轉(zhuǎn)化為顆粒狀。

2.1.1pH對活性污泥除磷效果的影響由于工業(yè)廢水的pH處在動態(tài)變化過程,通常在pH=6～9之間變化,個別偏低或偏高,可用酸堿進行適當(dāng)調(diào)節(jié)。而本廠廢水一般呈酸性,因此對于pH較低的廢水可加廢堿進行調(diào)節(jié),使曝氣池進水pH維持在7左右。事實上,活性污泥本身具有一定的抗沖擊能力,原因在于其中的微生物對pH的變化具有一定的適應(yīng)能力,通常曝氣池中的pH維持在6.5～8.5之間,且大多數(shù)細(xì)菌、藻類、放線菌等能夠相互凝聚而形成絮狀物,從而達(dá)到良好的凈化效果。結(jié)果見圖3。

圖3　pH對活性污泥除磷效果的影響Fig.3　Effects of pH on phosphorus removal by activated sludge

從圖3結(jié)果可以看出,在厭氧段,活性污泥在進水pH不同情況下的釋磷情況有所不同,pH為7、8時磷的釋放速度比較快,效果明顯(p<0.05);當(dāng)pH為6時,因水質(zhì)偏酸,一些微生物會出現(xiàn)自溶現(xiàn)象,致使一些細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽在酸性環(huán)境下溶解,這就造成了其在厭氧釋磷階段釋放速度快且釋磷量大,其釋磷速度和量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過pH為7和8時,但由于活性污泥自身具有一定抗沖擊能力,所以在后期好氧吸磷階段雖受影響,但仍具有一定除磷能力;而當(dāng)pH為9時,磷的釋放因受到抑制而出現(xiàn)先吸收后釋放的現(xiàn)象[16],這可能是由于進水成堿性,導(dǎo)致厭氧段生成了一些磷酸鈣、磷酸鎂沉淀,從而造成水中成了磷含量的暫時性下降。通過綜合比較可知,當(dāng)進水pH為7、8時,比較有利于聚磷菌對磷元素的吸收,其除磷率分別可達(dá)93%、89%。

2.1.2溫度對活性污泥除磷效果的影響考察溫度對活性污泥除磷效果的影響,結(jié)果見圖4。從圖4可知,在一定范圍的不同溫度條件下活性污泥都有比較好的除磷效果,也說明了活性污泥當(dāng)中存在適應(yīng)不同溫度條件的聚磷菌種類。在整個除磷工藝中,溫度對厭氧階段的釋磷能力影響較大。從圖4中結(jié)果還可以看出,高溫有利于提高磷的釋放速率,且在一定溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高除磷率會不斷得到增加,增加值非常明顯(p<0.05),但不能超過有效除磷的溫度上限。但溫度在40 ℃時,由于厭氧段會大量釋磷,如果要達(dá)到同樣的除磷效果,必然要延長曝氣時間,這樣不但會導(dǎo)致處理周期延長,而且還會多增加一定能耗。所以就溫度條件而言,將其控制在35 ℃左右較為理想。

圖4　溫度對活性污泥除磷效果的影響Fig.4　The effects of temperature on phosphorus removal rate of activated sludge

2.1.3反應(yīng)器不同運行參數(shù)對活性污泥除磷效果的影響活性污泥法的曝氣方式通?？煞譃橄拗菩云貧?、半限制性曝氣、非限制性曝氣三種,其處理效果及能耗各不相同。本研究在曝氣方式上采用厭氧/好氧交替的限制性曝氣方式,重在研究相同周期內(nèi)厭氧/好氧交替頻率對活性污泥除磷效果的影響。在其它條件基本不變情況下,通過改變厭氧/好氧交替時間(分別取10、20、30 min)進行實驗,結(jié)果見圖5。

圖5　不同交替頻率對活性污泥除磷效果的影響Fig.5　The variation of phosphorus removal rate in the different time between aerobic and anaerobic

從圖5結(jié)果可以看出,由于厭氧/好氧環(huán)境交替頻率的不同混合液中總磷含量呈現(xiàn)上下波動現(xiàn)象,但整體呈現(xiàn)下降趨勢。通過比較不同交替頻率下除磷效果可以發(fā)現(xiàn),不同間隔時間對活性污泥除磷效果大小依次為20 min>10 min>30 min,且當(dāng)間隔時間為10 min和20 min時除磷效果相差不大(p>0.05),這說明適當(dāng)提高厭氧好氧交替頻率可以提高活性污泥除磷效果,但并非越高越好,因為交替頻率過高可會能出現(xiàn)出水中總磷濃度略微偏高的現(xiàn)象,并且會導(dǎo)致操作麻煩和影響設(shè)備正常使用壽命。因此,對于好氧活性污泥除磷而言,將厭氧好氧交替頻率提高到滿足活性污泥中功能菌正常生長即可。

2.1.4不同厭氧時間對活性污泥除磷效果的影響釋磷是吸磷的前提,厭氧階段磷的釋放量越大,好氧階段對磷的吸收能力就越強,出水中磷的濃度就越低,處理效果就越好。所以,為了達(dá)到理想的除磷目的,必須對厭氧時間進行合理的控制,對于不同厭氧階段下聚磷菌的處理效果見圖6。

圖6　厭氧時間對活性污泥除磷效果的影響Fig.6　The variation of phosphorus removal rate of activated sludge in different anaerobic time

從圖6結(jié)果可以看出,在厭氧開始的0.5 h內(nèi)磷濃度的變化比較大,此后厭氧時間內(nèi)磷濃度會繼續(xù)升高,但上升幅度不是很大;在相同條件下,厭氧2 h左右時污水中磷濃度最高,可達(dá)到18.76 mg/L,效果非常明顯(p<0.05);相同曝氣時間4.5 h后,不同厭氧時間1、1.5、2 h的出水中磷濃度分別為1.32、0.43、1.43 mg/L。由于聚磷菌進行生物除磷需要水中具有足夠的可降解有機物,當(dāng)厭氧時間過長時,厭氧微生物會過量消耗水中的可降解有機物,最終會導(dǎo)致水中有機物質(zhì)消耗殆盡,磷去除率趨于平穩(wěn)(p>0.05),這就造成了在好氧曝氣階段聚磷菌不能過量吸磷,導(dǎo)致出水中總磷含量過高,達(dá)不到排放標(biāo)準(zhǔn)[17]。所以,選擇厭氧時間適當(dāng)即可,一般1.5 h足可達(dá)到釋磷充分,實現(xiàn)較好的除磷效果。

在最優(yōu)化條件下,比較原始污泥和添加聚磷菌對廢水中磷的去除效果,結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出,投加聚磷菌后污泥的除磷能力提高了13.7%,去除效果非常明顯(p<0.05)。

圖7　添加原始污泥和馴化污泥對廢水中磷去除效果的比較Fig.7　The caparation of phosphorus removal rate in adding different sludge system

2.2污泥微生物群落變化

對反應(yīng)器中活性污泥進行DNA的提取和純度檢測,結(jié)果如表3所示。

表4　細(xì)菌DGGE圖譜的分析結(jié)果Table 4　The analysis results of the bacterial 16S rDNA partial gene DGGE

注:ND未檢測到條帶,各組內(nèi)數(shù)值表示微生物所占相對百分比;組1表示馴化后污泥,組2表示原有污泥。

DNA擴增后結(jié)果見圖8所示。將擴增后的DNA進行電泳染色后,結(jié)果如圖8(b)所示。不難看出馴化后比馴化前可檢測到的條帶數(shù)量發(fā)生了改變,部分相同條帶更粗更亮。分析原因,可能是系統(tǒng)條件滿足部分微生物(如聚磷菌P2)生長代謝條件,快速生長繁殖,數(shù)量增加;這類微生物成為優(yōu)勢菌株后,對其他細(xì)菌的生長具有一定的抑制作用,導(dǎo)致部分微生物數(shù)量減少。馴化前后,系統(tǒng)中細(xì)菌種類和數(shù)量有明顯的變化。

表3　DNA含量及純度檢測Table 3　Testing the DNA of content and purity

圖8　16S rDNA V3 PCR擴增結(jié)果 和16S rDNA基因DGGE電泳圖Fig.8　16S rDNA V3 PCR amplification results and DGGE analysis of bacterial 16S rDNA regions 注:a.擴增圖,b.電泳圖;條帶最上方的 1表示馴化后污泥;2表示原有污泥。

對電泳后的條帶進行量的測定,得到表4的結(jié)果。污泥馴化前后一些細(xì)菌的量發(fā)生了較大的改變。圖表中不同條帶分別代表不同細(xì)菌種類,條帶數(shù)量和亮度分別指代細(xì)菌的種類和數(shù)量。從圖8b中可以看出,活性污泥在馴化前后條帶差異較大,馴化后比馴化前可檢測到的條帶較多且較亮,說明馴化后一些原本在群落中不占優(yōu)勢的微生物因生存條件的改變而逐漸占據(jù)優(yōu)勢,尤其是一些具有聚磷能力的微生物如菌株P(guān)2,因條件的適應(yīng)而快速繁殖,從而提高了活性污泥整體的除磷能力。

對電泳后的條帶進行切膠測序,結(jié)果見表4所示。由表4可以看出,污泥中聚磷菌P2(Citrobacter sp)為3號條帶,其數(shù)量有了較大的提高,含量從7.9%提高到14%。

3　結(jié)論

通過投加菌種及控制反應(yīng)條件對活性污泥進行馴化。經(jīng)過15 d的馴化,污泥從原有的灰黑色逐漸變?yōu)辄S褐色,并由之前的絮凝狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)化為顆粒狀體,活性污泥的除磷能力得到了大幅度提升。

對馴化后活性污泥的相關(guān)性能進行研究。結(jié)果表明:當(dāng)進水pH為7.0,有利于聚磷菌對磷元素的吸收;將溫度條件控制在35 ℃左右較為理想;厭氧好氧交替頻率20 min,釋磷階段將厭氧時間控制在1.5 h有助于磷的較好去除。

對馴化前后活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)進行研究,結(jié)果表明,活性污泥馴化前后微生物群種類和數(shù)量都發(fā)生了較大變化,一些原本在群落中不占優(yōu)勢的聚磷類微生物如聚磷菌P2,經(jīng)過馴化后能更好適應(yīng)環(huán)境逐漸成為優(yōu)勢菌株數(shù)量得到了增加,優(yōu)勢菌勢必對部分不適應(yīng)環(huán)境的微生物生長具有抑制作用,導(dǎo)致這類微生物數(shù)量的減少甚至消失。在廢水處理系統(tǒng)中投加高效聚磷菌,能較好的發(fā)揮聚磷菌的聚磷效果,從而有效提高了含磷廢水的除磷效果。

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Research on the sludge domestication by adding high effective phosphorus-accumulating bacterium P2and the change of the sludge microbial community

FANG Chun-yu,ZHOU Jian,MING Hong-mei,ZHAO Xing-xiu,CHEN Meng-en,YAO Xia

(Biotechnology Engineering Dept,Sichuan University of Science & Technology,Zigong 643000,China)

In order to make the phosphorus removal ability of the activated sludge in the original process further improved,the strain P2was added to the original sludge after expanding culture,then through CASS reactor according to the approximation optimal phosphorus removal conditions to the strain P2was domestication,and to detect the related sewage discharge index in the domestication process. When domesticated conducted to 15 d,the various indicators of effluent as phosphorus removal rate were basically stable,ending the first phase of domestication. Then inspect the sludge impact resistance,study on in different temperature,time,pH value and reaction parameters to the phosphorus removal ability,the results showed that the suitable pH was 7.0,a suitable temperature was 35 ℃,the change frequency was 20 min between the anaerobic and aerobic,and the anaerobic time was 1.5 hours. which the phosphorus removal rate reached 93.6%.In the optimum domesticated conditions,some phosphorus accumulating organisms,was not dominant in previous sludge,such as the strain p2,were due to be changed to the main organisms after being domesticated,the activated sludge microbial community structure changed greatly.

phosphorus-accumulating;sludge domestication;sludge microorganisms;the change of microorganisms community

2015-11-12

方春玉(1977-),女,碩士研究生,高級實驗師,主要從事環(huán)境生物技術(shù)方面的研究,E-mail:471315625@qq.com。

釀酒及生物技術(shù)四川省重點實驗室項目(NJ2014-05);瀘州老窖科研獎學(xué)金項目(15ljzk06);四川省大學(xué)生創(chuàng)新基金項目(201510622061);四川理工學(xué)院培育項目(2015PY02)。

TS261.9

A

1002-0306(2016)14-0196-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.031