賀小軍，馬春春，卞爾保，王洪亮，宗 鋼，趙 兵

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沉默Ska2基因對人膠質瘤細胞增殖的影響

賀小軍，馬春春，卞爾保，王洪亮，宗 鋼，趙 兵

目的 采用siRNA沉默Ska2基因，探討其對人膠質瘤細胞生長的影響及其潛在的分子機制。方法 對照組人膠質瘤細胞予以siRNA陰性序列轉染，實驗組予以siRNASka2序列轉染。每組細胞轉染48 h后應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析Ska2 mRNA表達情況。Western blot法分析Ska2、PCNA和Cyclin D1蛋白表達情況，MTT法及細胞克隆實驗分析Ska2對A172細胞增殖及克隆形成能力的影響。結果 qRT-PCR結果顯示實驗組Ska2 mRNA表達較對照組顯著減少（P＜0.01），Western blot結果顯示實驗組Ska2、PCNA和Cyclin D1蛋白表達水平亦較對照組顯著降低（P＜0.01），MTT實驗顯示實驗組中活細胞數明顯低于對照組（P＜0.05）；細胞克隆法顯示實驗組細胞的增殖克隆形成能力明顯低于對照組（P＜0.01）。結論 沉默Ska2基因、減少人膠質瘤細胞Ska2基因的表達能夠抑制膠質瘤細胞的增殖。

Ska2；膠質瘤；細胞增殖

網絡出版時間：2016-6-6 13：52：31 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.006.html

紡錘體與動粒相關復合物（spindle and kineto-chore associated complex，Ska）包括Ska1、Ska2和Ska3［1］。Hanisch et al［2］發(fā)現了Ska1，并通過酵母雙雜交技術進一步篩選得到一個新的能夠與Ska1結合的蛋白即FAM33A，將其重新命名為Ska2。近年，Ska家族的第3個成員Ska3也幾乎同時被發(fā)現并報道［3］。Ska2是一個最近鑒定的參與細胞周期調控與腫瘤發(fā)生發(fā)展的新基因［2，4］。Ska2在細胞周期中的作用，目前認為該基因可通過與Ska1、Ska3形成Ska復合體，維持有絲分裂中期赤道板和關閉紡錘體檢測點，保證細胞能夠“適時”完成有絲分裂中期并進入有絲分裂后期［2，5］。Hanisch et al［2］采用RNA干擾技術抑制Ska2表達后，大量細胞被停滯或延遲在有絲分裂中期，雖然細胞仍能最終完成有絲分裂，但細胞從有絲分裂前期進入后期所需的時間明顯延長。Shi et al［6］發(fā)現Ska2在小細胞肺癌和乳腺癌中呈現表達上調。此外，Ska2還可通過糖皮質激素受體等途徑參與細胞增殖調節(jié)和腫瘤發(fā)生發(fā)展［7-10］。然而，Ska2基因在人膠質瘤的作用尚未見文獻報道，該研究旨在探討siRNA沉默Ska2后對人膠質瘤A172細胞增殖的影響，為進一步深入研究Ska2在膠質瘤中的作用機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑 人膠質瘤細胞株A172購自上海生命科學研究院細胞庫；培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、胰酶消化液均購自美國Hyclone公司；脂質體Lipofectamine 2000、TRIzol均購自美國Invitrogen公司；Ska2抗體購自英國Abcam公司；PCNA、Cyclin D1抗體購自北京博奧生物公司；反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）購自日本TaKaRa公司；7900型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；20 μl的反應體系包括10 μl 2×SYBR Green PCR Master Mix購自美國ABI公司；5′和3′端引物（3 μmol/L）各1 μl和1 μl的cDNA模板、7 μl dd H2O購自上海生物科技有限公司；兔抗人Ska2、羊抗人β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG、兔抗羊IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL購自美國Thermo Fisher公司；FlexCycler多功能PCR儀購自德國Jena公司；MTT試劑購自美國Sigma公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、DMSO試劑、Western一抗稀釋液及RIPA裂解液（強）均購自上海碧云天公司；NanoPhotometer Pearl 330購自德國IMPLEN公司；siRNA寡核苷酸片段由上海吉瑪公司合成；Ska2引物由上海生物工程公司合成。siRNA-Ska2序列和siRNA陰性對照序列見表1。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1細胞轉染 購買50代以內人膠質瘤細胞株A172，將其培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，恒溫恒濕培養(yǎng)箱設定參數為37℃、5%CO2濃度。取對數生長期A172細胞，用0.25%胰酶消化液消化，800 r/min離心5 min，取適量培養(yǎng)基制成細胞懸液并計數，按40×104個/瓶接種于培養(yǎng)瓶中；接種24 h后，待培養(yǎng)瓶中細胞匯合達約70%時即可進行脂質體Lipofectamine 2000介導的轉染。第一組予以siRNA陰性對照序列（對照組）、第二組予以siRNA-Ska2序列（實驗組）進行轉染，以此建立細胞模型。

1.2.2qRT-PCR檢測A172細胞中Ska2 mRNA表達變化 細胞轉染后，提取實驗組及對照組細胞總RNA，分別將其逆轉錄成cDNA。用7900型熒光定量PCR儀進行反應擴增，Ska2上游引物：5′-CCGCTTTAAACCAGTTGCTG-3′，下游引物：5′-CTCTGCCGCAGTTTTCTCTT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3′，下游引物：5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTT-3′。反應條件如下：95℃預熱10 min；95℃變性15 s；60℃退火1 min，共45個循環(huán)。并于反應結束后記錄實驗組和對照組結果。以GAPDH作為內參，相對表達量=2-ΔΔCt值，以對照組mRNA表達量的均數為1，計算出實驗組mRNA的相對表達量。

1.2.3Western blot法檢測A172細胞中Ska2、PCNA和Cyclin D1蛋白表達情況 細胞轉染后，提取實驗組及對照組細胞總蛋白，用BCA試劑檢測各組蛋白濃度并定量。取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳（濃縮膠濃度5%，分離膠濃度8%），電轉30 min后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h；加入一抗為兔抗人Ska2抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，洗膜；加入二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG（1∶10 000），室溫輕搖1 h，洗膜；加入ECL反應液，暗室顯影、定影后掃描。以β-actin作為參照。

1.2.4MTT法檢測A172細胞生長 細胞培養(yǎng)和處理同前，將對照組正常A172細胞及實驗組轉染后A172細胞按1×104/孔接種于96孔板，每組設復孔5個，作常規(guī)培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)后0、12、24、48、72 h 5個時間點的培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)基，每孔依次加入MTT（5 mg/ml）10 μl，繼續(xù)孵育4 h后吸盡每孔中的培養(yǎng)液；加入DMSO 150 μl/孔，于水平搖床上振蕩6 min，測定492 nm的吸光度（absorbance，A）值。以時間為橫坐標，細胞存活率為縱坐標，繪制細胞生長曲線圖。存活率（%）=實驗組細胞A值/對照組細胞A值×100%。

1.2.4細胞克隆實驗檢測細胞增殖 細胞培養(yǎng)和處理同前，將轉染后的A172細胞按200個/孔接種于6孔板，設為實驗組；取相同數目的正常A172細胞接種于6孔板，設為對照組；每組各設3個復孔進行常規(guī)培養(yǎng)。每孔加入培養(yǎng)基2 ml，每3 d換液并觀察細胞增殖情況，10 d后棄培養(yǎng)基，每孔加入4%多聚甲醛1 ml固定30 min后，再加入美蘭染料0.8 ml染色，20 min后棄去染料，輕輕漂洗數次后晾干，在顯微鏡下觀察并進行拍照。

1.3統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，實驗數據以±s表示，組間比較采用t檢驗或方差分析。

2　結果

2.1A172細胞Ska2基因表達 qRT-PCR結果顯示，實驗組Ska2 mRNA水平的表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=7.28，P＜0.01），見圖1。

圖1　實驗組與對照組Ska2 mRNA的表達情況

2.2A172細胞Ska2蛋白表達變化 Western blot結果顯示，兩組內參β-actin蛋白的表達相近，而與對照組比較，實驗組Ska2蛋白表達明顯減少（t= 9.12，P＜0.01），見圖2。

圖2　Ska2蛋白的表達情況

2.3Ska2基因對A172細胞增殖的影響 MTT實驗結果顯示，與對照組比較，實驗組在轉染0、12、24 h時A172細胞生長差異無統計學意義，但轉染48 h 及72 h后，實驗組A172細胞較對照組生長明顯受抑制（t=8.27，P＜0.05），見圖3。

圖3　不同時間點A172細胞增殖生長情況

2.4Ska2基因對A172細胞增殖克隆形成能力的影響 10 d后將做細胞克隆實驗的6孔板放置在顯微鏡下，觀察實驗組與對照組細胞克隆增殖的情況。與對照組比較，實驗組細胞增殖明顯受到抑制（t= 10.45，P＜0.01），見圖4。

圖4　細胞克隆增殖形成情況 ×100

2.5A172細胞中PCNA和Cyclin D1蛋白表達變化 Western blot結果顯示，兩組內參β-actin蛋白的表達相近，而與對照組比較，實驗組PCNA和Cyclin D1蛋白的表達明顯減少（t=12.13，P＜0.01），見圖5。

圖5　PCNA與Cyclin D1蛋白的表達情況

3　討論

膠質細胞瘤是人腦組織中最常見的原發(fā)惡性腫瘤，有高度侵襲性、神經破壞性，被認為是人類最致命的癌癥之一［11］。人類對惡性膠質細胞瘤的發(fā)病機制尚不清楚，其治療策略相對有限，目前最主要的治療手段是手術聯合放化療，但治療效果仍然不甚理想。因此，研究膠質瘤基因改變的分子機制有助于從根源上發(fā)現與腫瘤相關的基因位點，通過阻斷和促進某位點基因的表達情況來說明此位點對膠質瘤致瘤性的影響。無限、不受控制地增殖是腫瘤細胞的特性，通過阻斷腫瘤細胞無限增殖的致癌基因無疑是研究的熱點。

Ska2是細胞分裂過程中必不可少的調控因子。文獻［6，12-13］證實Ska2參與肺癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。本實驗采用siRNA沉默Ska2，探究其對人膠質細胞瘤A172增殖的影響，將膠質細胞瘤Ska2基因沉默作為實驗組，同時建立僅予以siRNA陰性對照序列的對照組與之相比較。對兩組細胞進行實驗后，首先qRT-PCR和Western blot結果均證實Ska2-siRNA可明顯抑制膠質瘤細胞中Ska2 mRNA轉錄和蛋白表達。隨后，驗證Ska2是否影響膠質瘤細胞的增殖。MTT實驗結果提示實驗組在轉染Ska2-siRNA后，細胞增殖生長顯著受到抑制；克隆實驗結果證實了實驗組細胞增殖克隆形成能力顯著受到抑制。實驗結果均支持沉默Ska2后，可以抑制膠質瘤細胞的增殖活性。由此可見Ska2基因是一種重要潛在的原癌基因，在促進腫瘤增殖生長中有重要作用。

文獻［12］報道Ska2可通過參與糖皮質激素受體相關信號通路來調節(jié)細胞增殖。糖皮質激素因能抑制腫瘤細胞生長而被廣泛用作腫瘤化療藥物。某些小細胞肺癌細胞也因本身糖皮質激素受體缺陷而表現出對糖皮質激素的耐藥性［14］。Ska2通過與糖皮質激素受體的直接相互作用而調節(jié)糖皮質激素受體的功能及糖皮質激素的細胞增殖抑制作用。過表達Ska2可導致Dex激活的糖皮質激素受體轉錄激活活性得到進一步增強；而采用RNAi技術抑制Ska2的表達后，Dex激活的糖皮質激素受體轉錄激活活性和細胞增殖抑制能力均顯著削弱或喪失［12］。此外，敲減糖皮質激素受體β可特異性的抑制膠質瘤細胞增殖的能力［15］。

為進一步深入研究Ska2是如何調控膠質瘤細胞增殖分子機制，本研究檢測了增殖相關蛋白Cyclin D1與PCNA在實驗組和對照組中的表達情況。Western blot結果提示敲減Ska2基因后，實驗組增殖相關蛋白PCNA與Cyclin D1的表達含量與對照組比較明顯抑制。以上實驗結果說明沉默Ska2基因從而抑制膠質瘤細胞的增殖可能與減少了增殖相關蛋白Cyclin D1與PCNA的表達有關。

結合本次研究結果及Ska2對肺癌、乳腺癌等多種腫瘤的表達情況綜合考慮，Ska2基因與膠質瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。siRNA特異性沉默Ska2基因后，明顯抑制了膠質瘤細胞A172的增殖活性，因此Ska2基因可能是治療膠質瘤及其他腫瘤潛在的理想靶點。然而對于Ska2基因在膠質瘤細胞中的確切作用機制、作用途徑及Ska2基因與其他和膠質瘤相關的基因相互作用的關系尚有待于進一步闡明。

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Effects of Ska2 silencing on the cell proliferation of human glioma cells

He Xiaojun，Ma Chunchun，Bian Erbao，et al
（Dept of Neurosurgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To analyze the effects of Ska2 after siRNA silencing on human glioma cells growth and its potential molecular mechanisms.Methods The cultured human glioblastoma cell line A172 was divided into two different groups：the control group and the experimental group.The control group was treated with siRNA negative sequence transfection；the experimental group with siRNA-Ska2 sequence transfection.48 hours later，the expressions of Ska2 mRNA was analyzed by qRT-PCR.The protein expressions of Ska2，PCNA，and CyclinD1 were analyzed by Western blot.The proliferation ability and the colony-formation ability of cell were investigated through MTT Assay and cell cloning Assay.Results qRT-PCR analysis showed that mRNA expression in Ska2 of the experimental group was significantly reduced compared with the control group（P＜0.01）；Western blot indicated a great decline of Ska2 in PCNA and CyclinD1 protein expression in the experimental group（P＜0.01）；MTT Assay revealed that the number of viable cell was lower than that of the control group（P＜0.05）；cloning experiment indicated that colony-formation ability was weaker than that of the control group（P＜0.01）.Conclusion Silencing of Ska2 and reducing the gene expression of Ska2 in human glioma cells inhibit cell proliferation.

Ska2；glioma；cell proliferation

R 739.41

A

1000-1492（2016）07-0930-05

2016-03-23接收

國家自然科學基金青年基金（編號：81402078、81502149）；安徽省自然科學基金項目（編號：1508085MH194）

安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經外科，合肥 230601

賀小軍，男，碩士研究生；趙 兵，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhaopumcmd@yeah.net