項(xiàng)先旺，江 彤，陳傳俊，3

?

HPV16 E5、E6和E7基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及其感染口腔上皮細(xì)胞

項(xiàng)先旺1，江 彤2，陳傳俊1，3

目的 分別構(gòu)建HPV16 E5、E6和E7癌基因的重組慢病毒載體感染人口腔上皮細(xì)胞，為研究E5基因?qū)谇簧掀ぜ?xì)胞的致癌機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法 克隆HPV16 E5、E6和E7基因，分別構(gòu)建pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7重組慢病毒載體，與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集3種慢病毒上清液，分別感染口腔上皮細(xì)胞、腺嘌呤素篩選感染細(xì)胞，RT-PCR和Western blot法檢測(cè)目的基因的表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFPE6和pLVX-AcGFP-E7重組慢病毒載體，獲得3種慢病毒上清液，篩選得到3個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞株。RT-PCR和Western blot均可檢測(cè)到HPV16 E5、E6和E7基因在口腔上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。結(jié)論 本研究構(gòu)建的3個(gè)重組慢病毒載體能成功感染口腔上皮細(xì)胞。

人乳頭狀瘤病毒；HPV16癌基因；慢病毒載體；口腔上皮細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-6 13：52：31 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.010.html

人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宮頸癌發(fā)生的主要致病因子。大量的流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，HPV也與口腔癌的發(fā)生密切相關(guān)［1-2］。目前關(guān)于HPV與口腔癌關(guān)系的研究主要集中于對(duì)高危型HPV E6和E7基因的研究，它們都可與腫瘤抑制物結(jié)合并使其失活［3］。實(shí)際上，HPV E5基因有其特殊的生物活性，與腫瘤的發(fā)生關(guān)系同樣非常密切。E5基因可抑制細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期異常，甚至還能增強(qiáng)E6和E7基因?qū)?xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化作用［4-5］。Schiffman et al［6］比較不同型別HPV全基因組序列發(fā)現(xiàn)，有生物活性的E5基因總是存在于引起惡性腫瘤的高危型HPV基因組中，說(shuō)明E5基因在HPV致癌過(guò)程中可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，深入研究HPV E5基因的功能及其致癌性，可能是進(jìn)一步了解HPV致癌機(jī)制的重要突破口。該研究擬構(gòu)建HPV16 E5、E6和E7基因重組慢病毒載體，感染口腔上皮細(xì)胞，以期為研究高危型HPV E5基因在口腔上皮細(xì)胞癌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本采集 感染HPV16的口腔癌病理標(biāo)本由本實(shí)驗(yàn)室保存，取自臨床腫瘤組織；無(wú)菌口腔黏膜標(biāo)本則取自安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院小兒唇腭裂術(shù)中多余上皮。

1.1.2菌種及載體 大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pGEM-Teasy Vector購(gòu)自美國(guó)Promega公司；慢病毒核心質(zhì)粒pLVX-AcGFP-N1購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司；慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2G購(gòu)自美國(guó)Addgen公司。

1.1.3酶與試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser等工具酶均購(gòu)自日本TaKaRa公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、無(wú)血清培養(yǎng)基Defined Keratinocyte-SFM、分散酶DispaseⅡ、嘌呤霉素購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；293T細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；一抗（Mouse Anti-GFP）、二抗（Goat Anti Mouse）、hexadimethrine bromide、DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2方法

1.2.1HPV16 E5、E6和E7基因的克隆及3個(gè)慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的HPV16 （GenBank登錄號(hào)：KC935953）序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增E5、E6和E7特異性引物，見(jiàn)表1。上游引物5′端引入EcoR I位點(diǎn)，下游引物5′端引入BamH I位點(diǎn)。提取感染HPV16腫瘤標(biāo)本的總DNA，PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 14 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的DNA片段。EcoR I和BamH I雙酶切純化的目的片段，與同樣雙酶切的慢病毒載體pLVX-AcGFP-N1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證重組慢病毒載體 pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7攜帶的E5、E6和E7基因序列是否發(fā)生突變。

表1　引物序列

1.2.2重組慢病毒的包裝 分別將3個(gè)重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集病毒上清液，濃縮后分裝保存于-80℃冰箱。

1.2.33種慢病毒滴度測(cè)定 逐步稀釋法測(cè)定3種慢病毒滴度，分別在96孔板中接種293T細(xì)胞，第2天用完全培養(yǎng)基按（1～10-9）10個(gè)梯度稀釋病毒液，每孔加入100 μl稀釋后的病毒液，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)；48 h后觀察細(xì)胞中GFP的表達(dá)，若10-8梯度孔中分別有2、3和4個(gè)細(xì)胞GFP（+），則取平均值，此病毒滴度為3×108TU/ml。

1.2.4口腔上皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng) 將無(wú)菌口腔黏膜標(biāo)本置于2 mg/ml DispaseⅡ中，4℃消化過(guò)夜。次日，用眼科鑷分離獲取上皮層并用剪刀將其剪成1 mm×1 mm大小，胰酶消化10 min，含10%胎牛血清的DMEM中止消化。1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入Defined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。以1×104個(gè)/cm2接種到35 mm的培養(yǎng)皿中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底的70%～80%時(shí)，按1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.5獲得穩(wěn)定感染的細(xì)胞株 取P1代口腔上皮細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞融合度約70%時(shí)，換液，每孔分別加入pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7慢病毒100 μl，并在每孔中加入終濃度為8 μg/ml的ploybrene，隔天換液，加入終濃度為2 μg/ml嘌呤霉素，培養(yǎng)2周，即可得到穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)E5、E6和E7基因mRNA表達(dá)水平 分別取pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和 pLVX-AcGFP-E7慢病毒穩(wěn)定感染的口腔上皮細(xì)胞株。各提取細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄 cDNA第一鏈。以cDNA為模板，RT-PCR檢測(cè)E5、E6和E7。

1.2.7Western blot檢測(cè)E5、E6和E7蛋白表達(dá)水平 收集穩(wěn)定感染HPV16 E5、E6和E7基因的口腔上皮細(xì)胞株，PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液200 μl，冰上孵育3 min；將細(xì)胞收集到500 μl EP管中，置于冰上繼續(xù)裂解20 min，12 000 r/min、4℃離心30 min；加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃變性5 min；取30 μg樣品總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%脫脂奶粉液封閉2 h，加入Anti-GFP一抗，室溫孵育2 h；TBST洗膜4次，再加入二抗，室溫孵育1.5 h；TBST洗膜10次，加入新配置的Western blot化學(xué)顯色劑進(jìn)行顯色，5 min后拍照分析。

2　結(jié)果

2.1目的基因的擴(kuò)增 以感染HPV16腫瘤組織的總DNA為模板，分別用3對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出3條約250、500、300 bp的特異性條帶，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符。見(jiàn)圖1。

圖1　HPV16 E5、E6和E7基因的PCR產(chǎn)物

2.2重組慢病毒載體酶切和測(cè)序驗(yàn)證 重組慢病毒載體pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVXAcGFP-E7經(jīng)雙酶切體系驗(yàn)證，酶切片段大小符合理論值。說(shuō)明插入的E5、E5和E6基因讀碼框正確。測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證插入的基因序列未發(fā)生突變。見(jiàn)圖2。

2.3重組慢病毒滴度的測(cè)定 3種慢病毒pLVXAcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7分別感染293T細(xì)胞，逐步稀釋法測(cè)定滴度，分別為3 ×108、2×108、2×108TU/ml。

2.4口腔上皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)6～7 d，上皮細(xì)胞開(kāi)始增殖，15～20 d細(xì)胞開(kāi)始融合，融合的口腔上皮細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，呈鋪路石樣結(jié)構(gòu)排列。見(jiàn)圖3。

圖2　重組慢病毒質(zhì)粒的EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定

圖3　P1代口腔上皮細(xì)胞形態(tài)

2.5RT-PCR和Western blot檢測(cè)目的基因的表達(dá) 倒置顯微鏡下觀察顯示，慢病毒pLVX-AcGFPE5、pLVX-AcGFP-E6和 pLVX-AcGFP-E7轉(zhuǎn)染的口腔上皮細(xì)胞均有綠色熒光蛋白表達(dá)，說(shuō)明3種慢病毒均可轉(zhuǎn)染口腔上皮細(xì)胞。見(jiàn)圖4。RT-PCR檢測(cè)表明，在轉(zhuǎn)染3種慢病毒的口腔上皮細(xì)胞中，均可擴(kuò)增出特異性條帶，大小分別約為250、500、300 bp。見(jiàn)圖5。Western blot檢測(cè)顯示，在轉(zhuǎn)染3種慢病毒的口腔上皮細(xì)胞中，均檢測(cè)出特異性條帶，大小分別約為37、46、39 kDa，與理論大小相符。上述檢測(cè)結(jié)果表明，E5、E6和E7蛋白在口腔上皮細(xì)胞中均能成功表達(dá)，見(jiàn)圖6。

圖4　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒的口腔上皮細(xì)胞 ×100

圖5　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒口腔上皮細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR檢測(cè)

圖6　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒的口腔上皮細(xì)胞Western blot檢測(cè)GFP表達(dá)

3　討論

Sdek et al［7］利用HPV16 E6和E7基因轉(zhuǎn)染人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞引起永生化，與HPV16在宮頸癌的致病機(jī)制不同是他檢測(cè)到腫瘤抑制物p53上調(diào)，提示高危型HPV引起口腔癌的機(jī)制可能與宮頸癌不同，但其未做進(jìn)一步研究，尤其缺乏對(duì)HPV16致癌基因E5的研究。本課題組前期研究［8］顯示HPV16 E5基因可在一定程度上促進(jìn)人永生化口腔上皮細(xì)胞增殖，并對(duì)E6和E7基因mRNA表達(dá)量有一定的間接上調(diào)作用。值得注意的是，HPV16 E5蛋白分子量為10 ku，是由83個(gè)氨基酸構(gòu)成的疏水性膜聯(lián)合蛋白，隨著后期病毒DNA的整合，E5基因會(huì)發(fā)生缺失，提示在相關(guān)腫瘤形成的早期階段發(fā)揮重要作用［9］。E5蛋白可以與各種膜蛋白發(fā)生相互作用，主要與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合并增強(qiáng)其活性，誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度增生和抑制細(xì)胞凋亡，使一系列原癌基因過(guò)度表達(dá)［10］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［11］表明注射重組腺病毒HPV16 E5疫苗或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞E5肽和CpG寡核苷酸可顯著降低腫瘤的生長(zhǎng)。Hu et al［12］證實(shí)HPV16 E5蛋白能介導(dǎo)細(xì)胞融合，而細(xì)胞融合可充分誘導(dǎo)染色體不穩(wěn)定，從而使癌基因表達(dá)和細(xì)胞周期異常，導(dǎo)致腫瘤，HPV16 E5與E6和E7共表達(dá)時(shí)能促進(jìn)這些雙核細(xì)胞繁殖，也能增加雙核細(xì)胞的形成率。研究高危型HPV E5基因?qū)谇簧掀ぶ掳┬詫?duì)口腔癌的防治有重要的指導(dǎo)價(jià)值和實(shí)踐意義。

本實(shí)驗(yàn)選用的口腔上皮樣本材料來(lái)自于小兒唇腭裂術(shù)中多余口腔上皮，增殖能力較好，原代口腔上皮細(xì)胞可傳代培養(yǎng) 4～5代。文獻(xiàn)［13］顯示隨著年齡的增加，口腔上皮細(xì)胞傳代次數(shù)減少，成人的口腔上皮細(xì)胞只能傳至2～3代。同時(shí)本研究也表明P1代和P2代口腔上皮細(xì)胞與原代細(xì)胞生物學(xué)性狀接近，后隨著傳代次數(shù)增加，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞增殖減慢，融合時(shí)間延遲，細(xì)胞逐漸凋亡。

慢病毒載體是以人類(lèi)免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的病毒載體［14-15］。慢病毒核蛋白質(zhì)前整合復(fù)合物有噬核特性，從而使慢病毒對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均有感染能力，對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到穩(wěn)定持久性表達(dá)。其次，慢病毒還有初次感染后即喪失繼續(xù)感染的能力，有安全性好、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)、感染效率高等特點(diǎn)。在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究中，慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一，并且正在獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

本研究選擇慢病毒載體，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，成功構(gòu)建了慢病毒載體pLVX-AcGFP-E5、pLVXAcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7，均能感染口腔上皮細(xì)胞，RT-PCR和 Western blot均能檢測(cè)E5、E6和E7蛋白在口腔上皮細(xì)胞中表達(dá)，為后續(xù)3種慢病毒單獨(dú)感染或共感染口腔上皮細(xì)胞，闡明HPV16 E5基因與口腔癌的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

［1］Herrero R，Castellsagué X，Pawlita M，et al.Human papillomavirus and oral cancer：the international agency for research on cancer multicenter study［J］.J Natl Cancer Inst，2003，95（23）：1172-83.

［2］Smith E M，Ritchie J M，Summersgill K F，et al.Human papillomavirus in oral exfoliated cell and risk of head and neck cancer ［J］.J Natl Cancer Inst，2004，96（6）：449-55.

［3］Rampias T，Sasaki C，Weinberger P，et a1.E6 and E7 gene Silencing and cancer cells［J］.J Natl Cancer Inst，2009，101（6）：412-23.

［4］Kim M K，Kim H S，Kim S H，et al.Human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein as a new target for cervical cancer treatment ［J］.Biochem Phar Macol，2010，80（12）：1930-5.

［5］Ganguly N.Human papillomavirus-16 E5 protein：oncogenic role and therapeutic value［J］.Cell Oncol（Dordr），2012，35（2）：67 -76.

［6］Schiffman M，Herrero R，Desalle R，et al.The carcinogenicity of human papillomavirus types reflects viral evolution［J］.Virology，2005，337（1）：76-84.

［7］Sdek P，Zhang Z Y，Cao J，et al.Alteration of cell-cycle regulatory proteins in human oral epithelial cells immortalized by HPV16 E6 and E7［J］.Int J Oral Maxillofac Surg，2006，35：653-7.

［8］候?yàn)t瀟，江 彤，蔣欣泉，等.HPV16型 E5基因?qū)θ擞郎谇簧掀ぜ?xì)胞E6、E7基因表達(dá)的影響［J］.上?？谇会t(yī)學(xué)雜志，2011，20（4）：368-72.

［9］Conrad M，Bubb V J，Schlegel R，et al.The human papillomavirus type 6 and 16 E5 proteins are membrane-associated proteins which associate with the 16-kilodalton pore-forming protein［J］.J Virol，1993，67（10）：6170-8.

［10］Maufort J P，Williams S M，Pitot H C，et al.Humanpapillomavims16 E5 oncegene contributes to two stages of skin carcinogenesis［J］.Cancer Res，2007，67（13）：6106-12.

［11］Liao S J，Deng D R，Zeng D，et al.HPV16 E5 peptide vaccine in treatment of cervical cancer in vitro and in vivo［J］.J Huazhong Univ Sci Technol，2013，33（5）：735-42.

［12］Hu L，Platker K，Vorozhko V，et al.Human papillomavirus16 E5 induces bi-nucleated cell formation by cell-cell fusion［J］.Virology，2009，384（1）：125-34.

［13］丁桂聰，毛天球，楊維東，等.人口腔黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性的研究［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2000，16（4）：288 -90.

［14］Blomer U，Naldini L，Kafri T，et al.Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector［J］.J Virol，1997，71（9）：6641-9.

［15］Zufferey R，Nagy D，Mandel R J，et al.Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo［J］.Nat Biotechnol，1997，15（9）：871-5.

Construction of three lentiviral vectors expressing HPV16 E5，E6 or E7 oncogene and respective infection of oral epithelial cells with the vectors

Xiang Xianwang1，Jiang Tong2，Chen Chuanjun1，3
（1Dept of Oral and Maxillofacial Surgery，The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230061；2College of Plant Protection，Anhui Agricultural University，Hefei 230036；3Dept of Stomatology，Wannan Medical College，Wuhu 241002）

Objective To provide the basis for the study of HPV16 E5 gene inthe pathogenesis of oral squamous cell carcinoma by constructing three lentiviral vectors expressing HPV16 E5，E6 or E7 oncogene and transfecting oral epithelial cells with the vectors.Methods HPV16 E5，E6 or E7 oncogene was amplified using PCR and ligated into the lentiviral vector pLVX-AcGFP-N1 respectively to construct vectors pLVX-AcGFP-E5，pLVX-AcGFP-E6 and pLVX-AcGFP-E7，then respectively cotransfected 293T cells with packaging plasmids，viral supernatant was collected to respectively transfect oral epithelial cells.Afterpuromycin screening，oral epithelial cells with HPV 16 E5，E6，or E7 oncogene transfection were constructed，then reverse transcription PCR and western blotassays were performed for verifying HPV16 E5，E6 or E7 expression.Results pLVX-AcGFP-E5，pLVX-AcGFP-E6 and pLVX-AcGFP-E7 were successfully constructed，oral epithelial cells expressing HPV 16 E5，E6 or E7 oncogene wereacquired，HPV16 E5，E6 or E7 expression was confirmed in oral epithelial cellsthrough reverse transcription PCR and western blot assays.Conclusion Three lentiviral vectors expressing HPV16 E5，E6 or E7 oncogene can successfully infect oral epithelial cells.

human papillomavirus；HPV16 oncogene；lentiviral vector；oral epithelial cells

R 739.8

A

1000-1492（2016）07-0940-05

2016-03-08接收

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81172574）；皖南醫(yī)學(xué)院人才引進(jìn)科研啟動(dòng)基金資助

1安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，合肥 2300612安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，合肥 2300363皖南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，蕪湖 241002

項(xiàng)先旺，男，碩士研究生；陳傳俊，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ccj6318@sina.com