陳 才，吳繼雄，王 靚，何 非

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川陳皮素后處理減輕心肌缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞凋亡

陳 才1，吳繼雄1，王 靚2，何 非1

目的 研究川陳皮素后處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制。方法 選擇健康雄性C57BL/6小鼠48只，隨機(jī)均等分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、川陳皮素后處理組（NOB組）、川陳皮素后處理+PI3K特異性抑制劑LY294002組（NL組）。通過結(jié)扎小鼠左冠狀動(dòng)脈前降支30 min，再灌注120 min，制作小鼠心肌缺血再灌注模型。采用Evans Blue和TTC雙重染色法測量心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)及梗死區(qū)面積；TUNEL染色法檢測各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)；硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）濃度，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；Western blot檢測各組心肌的Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量，計(jì)算Bcl-2/Bax比值。結(jié)果 與Sham組相比，I/R組心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，心肌Akt、Bcl-2下調(diào)，Bax、Caspase-3上調(diào)，Bcl-2/Bax下降，MDA顯著升高，SOD顯著降低（P＜0.001）。與I/R相比，NOB組心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡顯著減少，心肌Akt、Bcl-2上調(diào)，Bax、Caspase-3下調(diào)，Bcl-2/Bax升高，MDA顯著降低，SOD顯著升高（P＜0.001）。與NOB組相比，NL組心肌梗死面積及凋亡顯著升高，心肌Akt、Bcl-2下調(diào)，Bax和Caspase-3上調(diào)，Bcl-2/Bax下降，MDA顯著升高，SOD顯著降低（P＜0.001）。結(jié)論 川陳皮素可減輕心肌缺血再灌注損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與PI3K-Akt通路激活降低氧化應(yīng)激有關(guān)。

川陳皮素；PI3K/Akt；心肌缺血再灌注；凋亡

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-6 13：52：31 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.012.html

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）多是由于冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜損傷、血小板聚集或痙攣引起血栓形成導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈急性閉塞。及時(shí)有效恢復(fù)冠脈血流可挽救損傷心肌，但隨后的再灌注可進(jìn)一步加重缺血心肌細(xì)胞損傷；藥物后處理在再灌注早期作為輔助性治療在臨床過程中減輕心肌缺血再灌注治療有良好前景。川陳皮素來源于蕓香科植物橘及栽培變種的成熟果皮，有有效的藥物活性，被普遍使用［1］。近期研究［2-3］顯示，川陳皮素可通過降低腦細(xì)胞凋亡從而減輕腦缺血及腦缺血再灌注損傷。川陳皮素藥理學(xué)作用逐步被人們發(fā)現(xiàn)，但川陳皮素對于心肌缺血再灌注是否有影響及其機(jī)制暫無相關(guān)研究。該實(shí)驗(yàn)評估川陳皮素后處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57BL/6小鼠48只，10 ～12周，22～28 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［SCXK（皖）2011-002］；本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)過安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑及儀器 川陳皮素（陜西慧科植物開發(fā)有限公司，純度超過98%，溶于生理鹽水包含0.5%Tween 80中配成比例為10 mg/10 ml）；TTC（氯化三苯基四氮唑）、Evans Blue（伊文氏藍(lán)）（美國Sigma公司）；LY294002［美國BIOMOL Research Laboratories（Plymouth Meeting，PA）公司］；TUNEL凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche Diagnostics公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3（美國Cell Signaling Technologies公司）；羊抗兔二抗（武漢博士德生物科技有限公司）；BL-420E生物信號采集分析系統(tǒng)、動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）。

1.3小鼠心肌缺血/再灌注模型 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不限飲水；隨機(jī)分為4組（n =12）。假手術(shù)組（Sham組）：僅過線不結(jié)扎；缺血再灌注組（I/R組）：小鼠左前降支結(jié)扎30 min，隨后松開結(jié)扎再灌注120 min；川陳皮素后處理組（NOB組）：缺血30 min，再灌注前5 min予以頸靜脈注射川陳皮素15 mg/kg；川陳皮素后處理+LY294002組（NL組）：再灌注5 min予以尾靜脈注射LY294002 0.3 mg/kg，再灌注5 min予以頸靜脈注射川陳皮素15 mg/kg。按照既往方法［4］構(gòu)建小鼠心肌缺血再灌注模型。利用1%戊巴比妥鈉（0.6 ml/100 g）腹腔麻醉，然后小鼠固定解剖臺，四肢連接心電圖機(jī)；予以頸部皮膚消毒剪毛，氣管插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)。第三或第四肋間距胸骨左緣0.5 cm逐層解剖小鼠胸腔，剪開心包，以伴行的左冠狀靜脈主干為標(biāo)記，在左心耳下約2 mm處用8-0無損傷縫合線穿過，以PE-10軟管墊于縫合線上，結(jié)扎冠脈前降支30 min，可見缺血心肌變白，心電圖出血ST段抬高，造成心肌缺血30 min。剪斷結(jié)扎線，心電圖可見ST回落及再灌注心律失常，缺血心肌由白色變紅。隨后關(guān)閉胸腔，持續(xù)再灌注2 h。

1.4TTC/Evans Blue染色 除Sham組外，于心肌再灌注120 min時(shí)，重新扎緊左冠狀動(dòng)脈前降支，經(jīng)頸靜脈注射1%伊文氏藍(lán)1 ml，可見染成藍(lán)色的為心肌非缺血區(qū)，未藍(lán)染的為心肌缺血區(qū)；心肌缺血區(qū)予以沖洗后濾紙吸干，-80℃冰凍10 min，沿心尖部垂直于心臟長軸切5片（厚為2 mm），置于1%的TTC溶液中，37℃水域鍋溫孵20 min，用福爾馬林固定，梗死心肌呈白色，缺血心肌呈紅色，進(jìn)行掃描拍照。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國Merdia Cybernetics公司）測量缺血危險(xiǎn)區(qū)面積和梗死區(qū)面積。

1.5TUNEL法測定心肌細(xì)胞凋亡 取左室缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌組織10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，每隔1 mm進(jìn)行切片；按照 TUNEL試劑盒說明書以原位端口末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡；光鏡下（×400）觀察病理結(jié)果：凋亡陽性的細(xì)胞呈棕褐色。每張切片隨機(jī)選4個(gè)互不重疊高倍視野，采用圖像分析軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6SOD活性和MDA濃度的測定 剪取左心室心肌，每50 mg心肌加入0.5 ml生理鹽水，再加入抑肽酶并煮沸10 min，3 000 r/min離心3 min后取上清液，-20℃保存。全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按照試劑盒說明書推薦的操作步驟測定血清T-SOD活性和MDA含量，于波長550 nm處測定各管吸光度（absorbance，A）值并計(jì)算SOD活性，波長532 nm處測定各管A值并計(jì)算MDA含量。

1.7Western blot檢測 Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3將心肌組織置于勻漿器中剪碎并勻漿，加400 μl單去污劑裂解液裂（含PMSF）置于冰上，裂解30 min后將裂解液移至1.5 ml離心管中，4℃12 000 r/min離心5 min，取上清液后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉（TBST緩沖液配制）室溫封閉1 h，加入一抗（1∶1 000）4℃搖床孵育過夜，TBST緩沖液洗脫×3次后加入二抗（1∶100），室溫孵育2 h后TBST緩沖液洗脫3次，化學(xué)發(fā)光法（ECL）法顯影、定影并膠片曝光。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，計(jì)算資料以±s表示，組間資料的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。方差不齊者采用非參數(shù)檢驗(yàn)，組間多重比較采用Tamhane法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1缺血/再灌注后心肌梗死面積顯著增加 與Sham組（2.88±0.45）%相比，I/R組（39.38± 2.04）%小鼠心肌梗死區(qū)面積顯著增加（χ2= 44.804，P＜0.001），兩組間缺血危險(xiǎn)區(qū)面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（46.88%vs 47.04%，F(xiàn)=0.547，P= 0.965）。I/R組小鼠心肌凋亡指數(shù)（49.88± 6.99）%明顯高于Sham組（3.90±2.48）%（χ2= 36.098，P＜0.001）。表明本實(shí)驗(yàn)成功建立了小鼠心肌缺血/再灌注模型。見圖1、2。

圖1　缺血/再灌注后心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)及梗死面積的變化（n=12）

圖2　缺血/再灌注后心肌凋亡指數(shù)的變化（n=12）

圖3　缺血/再灌注后心肌p-Akt表達(dá)水平的變化（n=12）

2.2缺血/再灌注后凋亡相關(guān)蛋白及氧化應(yīng)激水平的變化 與Sham組相比，I/R組小鼠心肌磷酸化-Akt（p-Akt）的含量顯著下降，為Sham組的0.42倍（χ2=41.696，P＜0.001）；I/R組小鼠心肌Cleavedcaspase-3含量顯著增加，為Sham組的4.73倍（χ2=44.091，P＜0.001）。見圖3、4。與Sham組相比，I/R組小鼠心肌Bcl-2的含量顯著下降，Bax顯著增加，Bcl-2/Bax為Sham組的0.39倍（χ2=44.151，P ＜0.001）。見圖5。與Sham組（26.29±5.40 U/mg protein）相比，I/R組（5.06±2.06U/mgprotein）小鼠心肌T-SOD含量顯著降低（F=63.433，P＜0.001）；與Sham組相比，MDA的含量則顯著升高［（180.47±7.07）nmol/mg protein，F(xiàn)=1 011.629，P＜0.001］。

圖4　缺血/再灌注后心肌　Cleaved-caspase-3表達(dá)水平的變化（n=12）

圖5　缺血/再灌注后心肌　Bcl-2/Bax比值的變化（n=12）

2.3川陳皮素對缺血/再灌注后心肌梗死面積的影響及LY294002的拮抗作用 為明確川陳皮素后處理是否有心肌保護(hù)作用及其可能機(jī)制，檢測了I/R、NOB及NL組小鼠梗死區(qū)面積和缺血危險(xiǎn)區(qū)面積。與IR組（38.69±2.25）%相比，NOB組（19.85± 2.84）%小鼠心肌梗死區(qū)面積顯著減小（χ2= 44.804，P＜0.001），而給予PI3K阻斷劑LY294002一定程度上可拮抗川陳皮素的保護(hù)作用，NL組（29.37±2.69）%心肌梗死區(qū)面積高于NOB組（P ＜0.001）。3組間缺血危險(xiǎn)區(qū)面積的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.965）。NOB小鼠心肌凋亡指數(shù)（32.11 ±9.42）%也明顯低于I/R（49.88±6.99）%（χ2= 36.098，P＜0.001），而LY294002處理組心肌凋亡指數(shù)（43.75±8.14）%也高于NOB組（P=0.023）。此結(jié)果說明川陳皮素后處理可以減少梗死區(qū)面積，減輕心肌細(xì)胞凋亡，此作用一定程度上可以被PI3K阻斷劑LY294002拮抗，提示川陳皮素后處理可能通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt的表達(dá)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。見圖6、7。

圖6　川陳皮素對缺血/再灌注后心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)及梗死面積的影響及　LY294002的拮抗作用（n=12）

2.4川陳皮素對缺血/再灌注后Akt、凋亡相關(guān)蛋白及氧化應(yīng)激水平的影響及LY294002的拮抗作用為進(jìn)一步明確川陳皮素后處理心肌保護(hù)作用的機(jī)制，檢測了I/R、NOB及NL組小鼠心肌Akt、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及氧化應(yīng)激水平。NOB組小鼠心肌p-Akt含量是I/R組的5.51倍（P＜0.001），而NL組p-Akt的含量是NOB組的0.5倍（P＜0.001）。此外，NOB組小鼠心肌caspase-3含量是I/R組的0.33倍（P＜0.001），Bcl-2/Bax是I/R組的8.14倍（P＜0.001），而NL組caspase-3的含量是NOB組的1.92倍（P＜0.001），Bcl-2/Bax是NOB組的0.47倍（P＜0.001）。

NOB組小鼠心肌T-SOD含量（21.13±4.71 U/ mg protein）明顯高于I/R組（5.06±2.05 U/mg protein）（F=63.433，P＜0.001），而 NL組 T-SOD含量（11.66±3.57 U/mg protein）則低于NOB組（P＜0.001）。此外，NOB組小鼠心肌 MDA含量（89.14 ±7.34 nmol/mg protein）明顯低于I/R組（180.47± 7.07 nmol/mg protein，F(xiàn)=1 011.629，P＜0.001），而NL組MDA的含量（136.78±6.13 nmol/mg protein）則明顯高于NOB組（P＜0.001）。說明川陳皮素預(yù)處理通過上調(diào)Akt的表達(dá)、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮心肌保護(hù)作用，此作用一定程度上可以被PI3K阻斷劑LY294002拮抗，提示Akt是川陳皮素心肌保護(hù)作用的重要效應(yīng)通路。見圖8～10。

圖7　川陳皮素對缺血/再灌注后心肌凋亡指數(shù)的影響及　LY294002的拮抗作用（n=12）

圖8　川陳皮素對缺血/再灌注后　Akt表達(dá)的影響及LY294002的拮抗作用（n=12）

圖9　川陳皮素對缺血/再灌注后　Bcl-2/Bax表達(dá)的影響及LY294002的拮抗作用（n=12）

3　討論

AMI是現(xiàn)今人類高致病和致死的主要病因之一，盡早恢復(fù)血流并維持缺血心肌氧和能量平衡對臨床有重大意義；PCI、溶栓及 CABG是主要的恢復(fù)血流方法，但研究顯示再灌注期間心肌細(xì)胞面臨著二次損傷，即為缺血再灌注損傷；凋亡在心肌缺血/再灌注損傷過程中起著重要作用，缺血/再灌注過程中通過產(chǎn)生氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體損傷、炎性細(xì)胞浸潤等多種機(jī)制導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，故降低細(xì)胞凋亡對防治缺血再灌注損傷有重要意義。陳皮素是從蕓香科柑橘屬橘子果皮中提取的一種多甲氧基黃酮類化合物，川陳皮素含有6個(gè)甲氧基，其代謝產(chǎn)物去甲氧化衍生物是主要活性物質(zhì)，有多種藥理學(xué)作用［5-7］，如抗腫瘤、改善記憶、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥物性作用。本研究表明川陳皮素可以顯著減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕缺血/再灌注損傷；此作用可能與川陳皮素抑制缺血/再灌注損傷過程中MDA的生成，促進(jìn)T-SOD的生成，由此減輕氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

圖10　川陳皮素對缺血/再灌注　Cleaved-caspase-3的影響及　LY294002的拮抗作用（n=12）

既往研究證實(shí)Bcl-2蛋白家族可調(diào)控細(xì)胞凋亡，其主要包括多種抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，在凋亡途徑中起著重要作用。促凋亡蛋白Bax、Caspase-3被激活后可激活凋亡途徑；而抗凋亡蛋白Bcl-2作用剛好與之相反，可抑制mPTP（線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔）開放，阻斷細(xì)胞色素C釋放，抑制半胱天冬酶激活從而抑制細(xì)胞凋亡［8-10］。所以，Bcl-2與Bax的比例決定著細(xì)胞受凋亡刺激時(shí)存活或死亡與否［11］。本研究顯示川陳皮素可以促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，故Bcl-2與Bax的比例升高，從而抑制細(xì)胞凋亡，這是川陳皮素心肌保護(hù)作用的另外一個(gè)可能的機(jī)制。

Akt是重要的細(xì)胞存活信號通路，是再灌注損傷存活激酶通路（RISK通路）的重要組成部分?；罨腁kt可磷酸化多種凋亡和存活調(diào)控分子，包括Bad、Caspase-9、eNOS、CREB、FKHR、GSK-3β等，最終抑制細(xì)胞凋亡［12］，在調(diào)控細(xì)胞存活通路中有著重要的作用。既往研究［11-13］顯示，缺血后處理及藥物后處理可通過激活PI3K-Akt通路減輕心肌缺血再灌注損傷。Zhang et al［2］川陳皮素可通過磷酸化Akt，激活Bcl-2減輕腦細(xì)胞凋亡，降低腦缺血損傷；Yasuda et al［3］川陳皮素可引起CREB磷酸化，磷酸化的CREB可引起B(yǎng)cl-2和BDNF的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)合本研究結(jié)果表明，在小鼠心肌缺血再灌注過程中，磷酸化Akt蛋白表達(dá)受抑制，而川陳皮素可上調(diào)磷酸化Akt的表達(dá)，并抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌梗死面積。Akt特異性阻斷劑LY294002一定程度上可拮抗川陳皮素后處理所產(chǎn)生的心肌保護(hù)作用，表現(xiàn)為Bcl-2與Bax比例降低，caspase-3表達(dá)增加，心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加。所以Akt信號通路參與了川陳皮素后處理的心肌保護(hù)作用。

本研究顯示川陳皮素預(yù)處理通過上調(diào)Akt和Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax和caspase-3的表達(dá)以及減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮心肌保護(hù)作用，此作用一定程度上可以被PI3K阻斷劑LY294002拮抗，提示Akt是川陳皮素心肌保護(hù)作用的重要效應(yīng)分子。受實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)所限，本研究未完善川陳皮素的心肌保護(hù)作用是否有濃度梯度效應(yīng)以及最佳作用劑量，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善。

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Nobiletin post-conditioning attenuates myocardial cell apoptosis following myocardial ischemia-reperfusion injury

Chen Cai，Wu Jixiong，Wang Liang，et al
（Dept of Cardiovascular，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the effects of nobiletin post-conditioningon myocardial ischemia-reperfusion injury and the possible mechanisms.Methods Forty-eight healthy male C57BL/6 rats were randomly allocated into sham operation group（Sham group），ischemia/reperfusion injury group（I/R group），nobiletin post-conditioning group（NOB group）and nobiletin post-conditioning group+LY294002 group（NL group）.Myocardial I/R injury was established by occlusion of anterior descending branch of left coronary artery for 30 min followed by 120 min reperfusion.The infarct size and the area at risk were measured by double-staining of Evans Blue and TTC.Myocardial apoptosis was detected by TUNEL.The concertration of MDA was measured by thiobarbituric acid（TBA）and xanthine oxidase was used to measure SOD.Western blot was adopted to detect the expression of the Akt，Bcl-2，Bax，Caspase-3 and ratio of Bcl-2/Bax.Results Compared with the sham group，the infarct size and apoptosis of I/R group was significantly increased，the expression of Bax and caspase-3 was up-regulated，Akt and Bcl-2 were decreased，and the ratio of Bcl-2/Bax was decreased，the concertration of MDA was significantly increased，but SOD was significantly decreased（P＜0.001）.Compared with the I/R group，the infarct size and apoptosis of NOB group were significantly decreased，the expression of Akt and Bcl-2 was up-regulated，while the expression of Bax and caspase-3 was down-regulated，and the ratio of Bcl-2/Bax was increased，the concertration of MDA was significantly decreased，but SOD was significantly increased（P＜0.001）.Compared with the NOB group，the infarct size and apoptosis of NL group were significantly increased，the expression of Akt and Bcl-2 was down-regulated，while the expression of Bax and caspase-3 was up-regulated，and the ratio of Bcl-2/Bax was decreased，the concertration of MDA was significantly increased，but SOD was significantly decreased（P＜0.001）.Conclusion Nobiletin postconditioning attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury and apoptosis，the mechanism associated with PI3K/ Akt pathway activation reduces oxidative stress.

nobiletin；PI3K/Akt；myocardial ischemia-reperfusion；apoptosis

R 541.4；R 961.1

A

1000-1492（2016）07-0944-07

2016-03-23接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81202631）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 2306012安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)教研室，合肥 230032

陳 才，男，碩士研究生；吳繼雄，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wjx8261@163.com