李　靜,樊明濤,孫慧燁

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

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植物乳桿菌對獼猴桃酒降酸效果的研究

李靜,樊明濤,孫慧燁

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

本研究旨在通過植物乳桿菌和酒類酒球菌引發(fā)獼猴桃酒的蘋果酸-乳酸發(fā)酵,篩選出獼猴桃果酒的后發(fā)酵的適宜菌株。實驗選用植物乳桿菌CS-1、XJA-2、XJ-14、XJ-25、520、542、544以及酒類酒球菌31MBR八株菌對自釀獼猴桃酒進行降酸。通過單因素實驗以及中心實驗設計(CCD)篩選最佳的獼猴桃酒后發(fā)酵菌株并優(yōu)化其降酸條件。結果表明植物乳桿菌520在酒中生長快速,降酸效果最佳。所得最佳條件為:接種量6.7%,pH3.5,溫度21.6 ℃。在該條件下驗證得到蘋果酸的降酸率為63.89%,因此可以有效降低獼猴桃果酒酸度,故植物乳桿菌520可作為新一代獼猴桃酒降酸的潛在菌株。

獼猴桃酒,植物乳桿菌,降酸

獼猴桃又稱“奇異果”,富含VC,被譽為“水果之王”,且含有豐富的可溶性膳食纖維,具有較強的抗氧化性能[1]。獼猴桃酒是其深加工產業(yè)的重要產品之一[2]。它的釀制過程同其他果酒釀造過程基本相同[3],營養(yǎng)價值較高。但目前獼猴桃果酒市場占有率較低,究其原因主要是獼猴桃酒酸度過高,口感尖酸、銳利,不能滿足消費者感官的需求,因而獼猴桃酒的降酸問題成為限制獼猴桃果酒產業(yè)發(fā)展的技術難題[4]。

果酒經過后發(fā)酵可使其口感更加圓潤、細膩,提高果酒的品質[5]。利用后發(fā)酵過程,接入可引發(fā)蘋果酸乳酸發(fā)酵的適宜菌株,有效降低獼猴桃酒的酸度[6-7]。葡萄酒中進行蘋果酸乳酸發(fā)酵的商業(yè)化菌株主要是酒類酒球菌[8],然而酒類酒球菌生長緩慢,作用效果遲緩,不利于工業(yè)化生產。已有研究證實,植物乳桿菌可在嚴苛的釀酒環(huán)境中生存,通過蘋果酸乳酸發(fā)酵降低果酒酸度,故可以作為MLF發(fā)酵的潛在菌株[9-11]。

本實驗選取四株分離自果酒的菌株:植物乳桿菌CS-1、XJA-2、XJ-14、XJ-25和三株分離自泡菜中的植物乳桿菌520、542、544,接入獼猴桃鮮酒,引發(fā)MLF發(fā)酵,測定發(fā)酵后的蘋果酸含量,旨在篩選出適宜菌株并得到最優(yōu)的發(fā)酵條件,為獼猴桃酒的生產奠定基礎。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌CS-1、XJ-14、XJ-25、XJA-2(從葡萄酒中分離)西北農林科技大學葡萄酒學院提供。-80 ℃保存的植物乳桿菌活化至第二代后,以2%接種量接種至MRS培養(yǎng)基中,37 ℃溫度下培養(yǎng)至對數末期(12～16 h)備用;植物乳桿菌520,542,544(從泡菜中分離)本實驗室分離、鑒定并保存;酒類酒球菌31MBR為實驗室保存菌株。

MRS培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母浸粉4 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,MnSO4·4H2O 0.05 g/L,乙酸鈉5 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,檸檬酸銨2 g/L,吐溫80 mL/L,用1 mol/L NaOH調pH至6.2～6.4,121 ℃滅菌20 min。

ATB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,葡萄糖10 g/L,MnSO4·4H2O 0.05 g/L,鹽酸半胱氨酸0.5 g/L,實驗室自制番茄汁250 mL/L,pH調至4.8,121 ℃滅菌20 min。

獼猴桃鮮酒:實驗室自釀[12](秦美獼猴桃,購自陜西省咸陽市楊凌區(qū)夏家村獼猴桃園)

蘋果酸標樣:購自阿拉丁試劑公司;酵母(excellence SP):購自yakult公司;果膠酶(Mcerozyme R-10):購自Lamothe abiet公司;亞硫酸:購自西隴化工股份有限公司。

DH-420A電熱恒溫培養(yǎng)箱北京科偉永興儀器有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司;HS-840μ型水平層流單人凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司;pH計上海雷磁儀器廠;UV-1700紫外可見分光光度儀SHIMADZU公司;LC-10AVPPLUS高效液相色譜儀日本島津公司;TRACE ISQ氣相色譜/質譜聯(lián)用儀美國Thermo Fisher公司。

1.2獼猴桃酒的釀造

成熟度適宜的獼猴桃果實打漿后經果膠酶處理24 h后,接入釀酒酵母進行酒精發(fā)酵,酒精發(fā)酵完成后進行倒罐,直至果酒澄清且瓶底無沉淀物。接入實驗菌株引發(fā)果酒的蘋果酸-乳酸發(fā)酵,至果酒中蘋果酸含量恒定后倒罐,至澄清即得到獼猴桃果酒的成品。

1.3實驗方法

1.3.1獼猴桃果酒理化指標的測定pH的測定:用pHS-3C雷磁pH計進行測定;總酸(以酒石酸計)測定:酸堿滴定法(GB/T 15038-1994);可溶性固形物(TSS)測定:用手持折光儀測定;總還原力:參照Oyalzu(1986)方法進行測定[13];總酚含量測定:福林-酚(Folin-Ciocaheus)法;酒精度測定:酒精計測定。

1.3.2單因素實驗菌株篩選實驗選用7株植物乳桿菌和酒類酒球菌 31MBR在室溫條件下,以獼猴桃鮮酒體積為基準接入6%(v/v)的菌株(108cfu/mL)[14],定期取樣HPLC法測定蘋果酸含量至蘋果酸含量恒定。計算各菌株對獼猴桃酒的蘋果酸降酸率。

各實驗因素對降酸效果的影響以獼猴桃酒中蘋果酸含量為響應指標,經預實驗確定環(huán)境溫度、接種量和初始pH對響應值影響顯著。在其他因素水平不變的條件下,單因素實驗分別測定溫度為14、18、22、26、30 ℃,接種量為2、4、6、8、10(v/v),初始pH為3、3.2、3.4、3.6、4.0時的降酸率。

1.3.3中心實驗設計(CCD,Central Composite Design)以獼猴桃酒中蘋果酸含量的降酸率作為響應值,選取單因素實驗得到的最優(yōu)點為中心水平,進行中心實驗設計[15]。

1.3.4HPLC法測定蘋果酸含量色譜柱:Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm);柱溫:40 ℃;檢測波長:210 nm,二極管陣列檢測器;流動相:質量分數為0.01的磷酸氫二鉀溶液(去離子水配制),用磷酸調節(jié)pH至2.9,流速:0.6 mL/min。

1.3.5蘋果酸降酸率的計算降酸率(%)=(1-C/C0)×100

C-植物乳桿菌降酸處理后,獼猴桃酒殘余蘋果酸含量(以蘋果酸計),mg/L;C0-空白組,即未經后發(fā)酵的獼猴桃酒中蘋果酸含量,mg/L。

1.6.5數據處理運用Design export 7.0軟件對實驗得到的結果進行多元二次模型方程的建立以及方差分析,并利用響應面方法得到各個因素的最優(yōu)水平。二次旋轉中心實驗的因素水平(如表1)。

表1　二次旋轉中心實驗因素水平

2　結果分析

2.1獼猴桃酒的理化指標

獼猴桃汁經酒精發(fā)酵得到鮮酒,鮮酒(1 ℃)經倒罐并澄清至瓶底無沉淀物,即為實驗組獼猴桃酒。獼猴桃酒在陳釀的過程中,還原力較為穩(wěn)定,但多酚等具有抗氧化能力的物質被氧化,或者分解為不具有抗氧化能力或者該能力較弱的單酚,故測得總酚含量(沒食子酸當量)變小。

2.2單因素實驗結果

2.2.1獼猴桃鮮酒中不同植物乳桿菌降酸效果計算得到實驗菌株的蘋果酸降酸率(如圖1)。結果表明實驗菌株都具有一定的降酸能力,而植物乳桿菌520能力較強,可將獼猴桃鮮酒中53.22%的蘋果酸降解,比酒類酒球菌31MBR的降酸率高出3.28%。而降酸最弱的菌株為植物如柑橘CS-1,降酸率僅達到36.16%。實驗得出酒類酒球菌31MBR的蘋果酸降酸率為49.94%,低于相關研究中的處理結果,原因是獼猴桃鮮酒的酸度較高,初始pH僅為3.19,在該過酸條件下,酒類酒球菌不能十分高效的引發(fā)蘋果酸乳酸發(fā)酵。植物乳桿菌520在獼猴桃酒中降酸效率較高,能較顯著改善獼猴桃果酒的口感和品質。

表2　獼猴桃酒的基礎理化指標

圖1　不同植物乳桿菌在獼猴桃鮮酒中的蘋果酸降酸率Fig.1　The deacidification of different Lactobacillus plantarum in kiwifruit wine

2.2.2各因素對降酸效果的影響環(huán)境溫度、初始pH和植物乳桿菌接種量三個因素對于MLF發(fā)酵的作用較為顯著(如圖2所示)。由圖2a所示,隨著植物乳桿菌接種量的增大,蘋果酸降酸率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢,蘋果酸降酸率在植物乳桿菌的接種量為6%時達到最大。接種量為6%～8%時,蘋果酸降酸率基本保持不變,接種量繼續(xù)增大則蘋果酸降酸率有輕微下降趨勢?？赡苁怯捎诮浘凭l(fā)酵,獼猴桃果酒中殘留的營養(yǎng)素含量有限,接種量過大在MLF前期可有效促進菌株量迅速增大,但到了發(fā)酵后期果酒不能供給單位體積生物量足夠的營養(yǎng)物質[15],導致菌株大量死亡,發(fā)酵周期縮短反而不利于菌株的增殖。圖2b顯示環(huán)境溫度升高至22 ℃時,蘋果酸降酸率達最大,隨著溫度繼續(xù)升高蘋果酸降酸率呈下降趨勢。植物乳桿菌對溫度具有較明顯的敏感性。如圖2c所示,菌株在pH 3.0、3.2、3.4、3.6、3.8時均能夠生長,但隨著初始pH的增大蘋果酸降酸率呈現(xiàn)出先增大后減少的趨勢,且初始pH為3.4時降酸率達最大。

圖2　MLF的初始條件對于蘋果酸降酸率的影響Fig.2　The influence of different initial factors to the rate of deacification for malic acid of kiwifruit wine

2.2二次旋轉中心組合實驗

依據單因素實驗結果,設計中心組合旋轉實驗,選定環(huán)境溫度、pH和菌株接種量的中心值為22 ℃、3.4和6%進行實驗,以蘋果酸降酸率作為響應值,得到植物乳桿菌降酸效果最優(yōu)時的因素水平。實驗設計編碼以及實驗結果如表3所示。

表3　二次旋轉中心組合實驗結果

對二次旋轉中心實驗結果進行方差分析和顯著性檢驗,其結果如表5和表6所示。從回歸模型的方差分析可以看出,回歸方程的失擬項不顯著(p>0.05),可推斷出選用的二次方程模型是適合的?；貧w方程的顯著性檢驗得到該模型具有顯著性(p<0.01),可說明該模型的預測值與真實值較為吻合,故該模型成立。

表5　回歸模型的方差分析

響應面分析所得的因子變化與實驗結果之間的相互作用真實可靠。經回歸擬合之后,實驗因子對于響應值的對應關系可用二次回歸方程表示。

Y=58.28+2.14A+3.36B+0.62C+4.99AB-5.41AC-0.82BC-5.28A2-6.24B2-3.83C2

在α=0.05的顯著水平下,剔除不顯著項之后,二次回歸方程可簡化為

Y=58.28+2.14A+3.36B+4.99AB-5.41041AC-5.28A2-6.24B2-3.83C2

簡化所得二次回歸模型是顯著的,回歸方程與實測值擬合較好。進一步對回歸方程進行偏相關t檢驗,得到各項均在α=0.05的顯著水平上顯著(p<0.05),故剔除不顯著因素后實驗所選取因素(初始pH和接種量)對實驗結果均影響顯著。

構建蘋果酸降酸率與環(huán)境溫度、初始pH和接種量的三維空間響應面圖,各因素之間的交互作用如圖3～圖5所示。

圖3　接種量和初始pH對蘋果酸降酸率的響應面圖Fig.3　Response surface of inoculum size and initial pH on the deacification rate of malic acid

圖4　接種量和溫度對蘋果酸降酸率的響應面圖Fig.4　Response surface of inoculum size and temperature on the deacification rate of malic acid

圖5　初始pH和溫度對蘋果酸降酸率的響應面圖Fig.5　Response surface of initial pH and temperature on the deacification rate of malic acid

回歸方程所作的響應面立體分析圖3～圖5,分別反映了接種量、起始pH、溫度這3個因素的兩兩交互作用對響應值的影響。因擬合所得方程的二次項系數均為負值,故其所表征的拋物面開口向下,具有極大值點。利用Design Expert 7.0軟件,計算分析得到,植物乳桿菌接種量為6.7%,pH3.5,溫度為21.6 ℃時蘋果酸降酸率最大,且軟件預測中心點對應響應值為64.57%。

2.3主因子效應分析

由方差分析以及優(yōu)化得到的回歸方程可知接種量(A)、pH(B)會對響應值蘋果酸降酸率有顯著影響(p<0.05),而溫度(C)對蘋果酸降酸率影響不顯著(p>0.05),且歸方程的一次系數B>A,即三因素對于響應值的影響:pH>接種量>溫度,結果與對獼猴桃酒總體品質研究[2]的結果一致。

2.4驗證實驗

利用Design Export 7.0 優(yōu)化得到的最適條件進行驗證實驗(6個平行組),HPLC法測定獼猴桃酒經過植物乳桿菌520進行MLF發(fā)酵獼猴桃酒的蘋果酸減少量,經計算得蘋果酸降酸率的平均值為63.89%,與模型的預測值64.57%較為接近。

2.5討論

獼猴桃果酒的微生物降酸主要通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵實現(xiàn),蘋果酸乳酸酶是乳酸菌進行蘋果酸乳酸發(fā)酵的關鍵酶。實驗菌株接入獼猴桃鮮酒,菌株對環(huán)境的適應能力不同,導致其生長狀況存在差異,同時蘋果酸乳酸酶(MLE)的分泌量和活力也不同[16]。菌株達到穩(wěn)定期后,因適應能力的差異導致菌株穩(wěn)定期長短和分泌蘋果酸乳酸酶量和活力具有明顯差異,故導致不同實驗菌株對獼猴桃酒的降酸效果不同,需篩選出適宜獼猴桃酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵的菌株。

環(huán)境溫度和初始pH對植物乳桿菌的作用包括菌株的生長狀況和菌株的產酶特性兩個方面,因而控制該因素變化可得到降酸效果最優(yōu)的條件。理論上講,初始pH越高,則蘋果酸乳酸酶的活力則越強,但是化學方法調節(jié)pH會破壞酒體的微生物穩(wěn)定性,故實驗結果中實驗菌株的的降酸能力并未隨pH的增大而一直增大。環(huán)境溫度較低時,菌株生長受到抑制,因而產酶量和酶活力都較低,導致降酸效果不理想。隨著溫度升高,酶活力升高,但是果酒環(huán)境中實驗菌株的生長可能會受到抑制。經實驗降酸效果最優(yōu)時的環(huán)境溫度和初始pH分別為21.6 ℃,pH3.5。

綜上,植物乳桿菌的產酶活性和產酶量會受到環(huán)境影響,且菌株的生長狀況及酒體的微生物穩(wěn)定性都可能在一定程度影響微生物降酸的效果和風味[17]。但考慮到蘋果酸乳酸酶是誘導酶[18],通過改良環(huán)境因素可能使菌株產酶量和產酶活性可得到一定的增加。關于增加果酒中菌株的產酶量和產酶活性的途徑,有待進一步研究。

3　結論

經實驗七株不同來源的植物乳桿菌進行獼猴桃酒的降酸效果不同,篩選出植物乳桿菌520在獼猴桃酒中降酸效果最優(yōu)。單因素實驗和中心旋轉組合實驗得到在植物乳桿菌接種量為6.7%,pH3.5,溫度為21.6 ℃該條件下,蘋果酸消耗率的平均值為63.89%,降酸效果得到有效提高。

故分離自泡菜的植物乳桿菌520接入獼猴桃酒,引發(fā)蘋果酸乳酸發(fā)酵可以有效降低獼猴桃酒的蘋果酸含量、改善其口感,是一株具有商業(yè)化潛力的獼猴桃果酒生物降酸菌株。

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Effect ofLactobacillusPlantarumon the Deacification of Kiwifruit Wine

LI Jing,FAN Ming-tao,SUN Hui-Ye

(College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

The aim of this study was to investigate the secondary fermentation of kiwifruit wine inducted byLactobacillusplantarumandOenococcusoeniso as to screen the starter cultures for malolactic fermentation(MLF)by comparing the deacidification. 7 different isolates ofLactobacillusplantarum(CS-1,XJA-2,XJ-14,XJ-25,520,542,and 544)andO.oeni31MBR associated with the MLF were used in the study. By conducting single factors and central composite design(CCD),the suitable levels were screened out for MLF. According to rate of deacidification for malic acid,L.plantarum520 was a considerable strain for kiwifruit wine,and the centre point were 6.7 percent for inoculum size and pH3.5 at 21.6 ℃. Under this optimized condition,the rate of deacidification for malic acid achieved 63.89 percent. All these characteristics,together with their ability to conduct MLF,makingL.plantarum520 suitable for a new generation of MLF starter cultures to reduce the acidity and improve the flavor of kiwifruit wine.

kiwifruit wine;Lactobacillusplantarum;deacidification

2015-05-15

李靜(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵研究,E-mail:

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項-園藝作物產品加工副產物綜合利用(201503142)；西安市科技計劃項目-冷凍濃縮技術生產優(yōu)質葡萄酒和低醇獼猴桃酒的試驗研究(NC1318)。

TS261.1

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000