應聰萍,王　瑤,李永成

(海南大學食品學院,海南?？?570228)

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一株產幾丁質脫乙酰酶絲狀真菌的發(fā)酵條件優(yōu)化研究

應聰萍,王瑤,李永成*

(海南大學食品學院,海南?？?570228)

針對已篩選出的一株能生產幾丁質脫乙酰酶(CDA)的海洋絲狀真菌,考察其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。通過單因素與正交實驗得出該菌的最佳產酶條件為:初始pH為6.0,發(fā)酵溫度為30 ℃,發(fā)酵時間為108 h,葡萄糖濃度7 g/L,酵母浸膏濃度7 g/L,氯化鈣濃度0.75 g/L,幾丁質濃度1.25 g/L,NaCl濃度為1.4%。通過酶活的測定,發(fā)現該絲狀真菌合成的幾丁質脫乙酰酶主要是胞外酶。在最佳發(fā)酵條件下該絲狀真菌的最高CDA胞外酶活為21.37 U/mL。是一株具有開發(fā)潛力的幾丁質脫乙酰酶生產菌株。

幾丁質,殼聚糖,幾丁質脫乙酰酶

殼聚糖(chitosan)是一種比較特殊的可食性動物纖維,含有游離氨基堿性陽離子[1],大多通過蝦、蟹外殼中的幾丁質脫乙酰而制備[2]。殼聚糖在1985年被Rouget發(fā)現并提取出來,至今,這類天然高分子由于其優(yōu)良的性能如抑菌性、保濕性、吸附性等被各行各業(yè)廣泛關注,在食品、化工、醫(yī)藥、化妝用品等領域有廣泛應用[3]。此外,在國家標準GB-2760中,殼聚糖因具有增稠、被膜功能而被作為食品添加劑[4]。在2014年6月,新的殼聚糖的國家標準正式實施。我們可以從GB 29941-2013中看到殼聚糖在我們的日常生活中應用越來越多[5]。

目前制備殼聚糖的方法有兩大類。一類是化學法,采用濃堿熱解脫去幾丁質中的乙?；?此法是工業(yè)上比較完善的方法,但該法會帶來嚴重的環(huán)境污染問題[6]。另一類是生物法,這類方法包括幾丁質脫乙酰酶法、微生物培養(yǎng)法、發(fā)酵工廠廢菌體生產法等[7]。通過幾丁質脫乙酰酶水解幾丁質生產殼聚糖,在實驗程度上已有一定成果[8]。盡管該法克服了環(huán)境污染問題,但由于脫乙酰酶法活性不高,現階段還不能進行工業(yè)化大規(guī)模生產。因此,通過尋覓新菌種或選用基因工程、誘變育種[9-10]等手段獲取具有穩(wěn)定遺傳性狀的產高活性幾丁質脫乙酰酶的工程菌將成為重要研究方向。

目前,以海洋絲狀真菌為來源研究幾丁質脫乙酰酶的不多[11],而海洋微生物來源的幾丁質脫乙酰酶具有獨特優(yōu)勢如耐高鹽度等[12-13],實驗選用海邊紅樹林土壤中篩選出的一株絲狀真菌,通過單因素實驗和正交實驗獲得其最佳發(fā)酵條件,提升該菌株的產酶能力和酶活,并為今后幾丁質脫乙酰酶法制備殼聚糖的進一步研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種:海洋絲狀真菌,從?？跂|寨港紅樹林的土壤中篩選出來,4 ℃保藏于實驗室冰箱中。

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯300 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,氯霉素0.1 g,最終pH6.0±0.2,定容至1 L,121 ℃高溫滅菌 16 min。

種子培養(yǎng)基:酵母浸膏5.0 g,葡萄糖2.5 g,硫酸銨4.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,膠體幾丁質1.25 g,NaCl 1.0%,初始pH6.0,定容至1 L,121 ℃高溫滅菌16 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母浸膏5.0 g,葡萄糖2.5 g,硫酸銨4.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,膠體幾丁質1.25 g,NaCl 1.4%,初始pH6.0,定容至1 L,121 ℃高溫滅菌16 min。

實驗設備:T6新世紀紫外可見分光光度計、JB-CJ-1FX超凈工作臺、LRH-250A生化培養(yǎng)箱、TGL-16M離心機、GM-1.0A隔膜真空泵、PHS-3C pH計、HH-4數顯恒溫水浴鍋、HZQ-X300C恒溫振蕩器、Fuhe 85-1恒溫磁力攪拌器。

1.2實驗方法

1.2.1菌種的活化將4 ℃保藏的絲狀真菌劃線接種于PDA斜面培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,使菌種活化。

1.2.2培養(yǎng)方法

1.2.2.1種子培養(yǎng)方法挑取一塊長勢良好的菌種斜面(0.5 cm×0.5 cm),接種于種子液培養(yǎng)基中,在30 ℃、180 r/min條件下搖瓶培養(yǎng)60～72 h。

1.2.2.2發(fā)酵培養(yǎng)方法以1 mL/50 mL的比例將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為50 mL/250 mL,在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)108 h,進行幾丁質脫乙酰酶的酶活測定。

1.2.3培養(yǎng)條件的確定

1.2.3.1發(fā)酵培養(yǎng)基成分影響具體實驗參數見1.1中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方,培養(yǎng)方案見1.2.2.2,其他實驗條件如下。

碳源種類:發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源分別為葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖。

碳源濃度:碳源濃度分別定為0,1,2.5,4,6.5,8 g/L。

氮源種類:發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源分別為牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨。

氮源濃度:氮源濃度分別定為2.5,5,7.5,10,12.5 g/L。

無機鹽種類:發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽分別為硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵、硫酸銅、氯化鈣、七水合硫酸鋅、磷酸二氫鉀。

無機鹽濃度:無機鹽濃度分別定為0,0.75,1.5,2.25,3 g/L。

膠體幾丁質添加量:膠體幾丁質濃度分別定為0,1,1.25,2,3,4 g/L。

滲透壓:氯化鈉濃度分別定為0.8%,1%,1.2%,1.4%,1.6%進行滲透壓的研究。

1.2.3.2發(fā)酵條件的影響發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖濃度7 g/L,酵母浸膏濃度7 g/L,氯化鈣濃度0.75 g/L,幾丁質濃度1.25 g/L,NaCl 1.4%。,培養(yǎng)方案見1.2.2.2,其他實驗條件如下。

pH:初始pH分別定為5.00,5.50,6.00,6.50,7.00。

培養(yǎng)溫度:培養(yǎng)溫度分別定為24,26,28,30,33,35 ℃。

1.2.4幾丁質脫乙酰酶(CDA)酶活測定方法

1.2.4.1CDA酶液的提取將發(fā)酵液在4 ℃、3000 r/min條件下離心10 min,上層清液即為胞外酶提取液;將菌絲體低溫抽濾,稱重,加入預冷0.05 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液和石英砂,在低溫環(huán)境中碾磨,漿液立即進行4 ℃、3000 r/min、10 min條件的離心,所得上清液即為胞內酶提取液[14]。

1.2.4.2酶活的測定方法測定酶活的原理為:以對硝基乙酰苯胺為底物,CDA可脫除對硝基乙酰苯胺的乙?；蓪ο趸桨?對硝基苯胺在400 nm處有最大吸收峰。通過測定產物溶液在400 nm處的吸光值,來反映CDA的酶活值。

具體測定方法為:10 mL具塞試管中加入1 mL 200 mg/L的對硝基乙酰苯胺溶液、3 mL 0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液,50 ℃水浴3 min,加入1 mL酶液,50 ℃水浴15 min,沸水浴終止酶促反應,加水定容至10 mL,若出現渾濁現象,在3000 r/min條件下離心10 min,在400 nm處測定吸光值。空白對照組添加1 mL滅活酶液,其余同上。在該反應條件下每小時產生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U/mL)[14]。

1.2.5培養(yǎng)基組分因素水平的確定選取碳源濃度(A)、氮源濃度(B)、無機鹽濃度(C)、幾丁質濃度(D)4個因素,每個因素均在合理范圍內取3個值進行正交實驗研究,具體詳見表1。

表1　因素水平表

2　結果與分析

2.1絲狀真菌的生長曲線

生長曲線可以反映液體培養(yǎng)基中微生物群體的生長狀況[15]。實驗表明,該菌株0～12 h為延滯期,12～60 h為對數生長期,60 h以后進入穩(wěn)定期。一般情況下,種子液處于對數生長期時活力最強,故實驗選擇培養(yǎng)60 h的種子液進行接種,具體見圖1。

表2　胞內酶活和胞外酶活對比表

圖1　真菌生長曲線Fig.1　Growth curve of fungus

注:培養(yǎng)條件:酵母浸膏5.0 g/L,硫酸銨4.0 g/L,磷酸二氫鉀1.5 g/L,膠體幾丁質1.25 g/L,NaCl 1.0%,葡萄糖濃度見表1,初始pH6.0,在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)108 h。

2.2胞內酶活和胞外酶活對比

實驗發(fā)現,菌株的胞內酶活遠遠小于胞外酶活,即菌株所產幾丁質脫乙酰酶主要為胞外酶。因此,后續(xù)實驗均只進行胞外酶活的測定。

2.3酶合成過程曲線

酶合成隨培養(yǎng)時間變化情況如圖2所示。發(fā)酵液中酶活于108 h達到最大值20.82 U/mL,此時細胞生長處于穩(wěn)定期。在0～108 h之間酶活逐步增長,108 h之后酶活開始下降。分析酶活值下降的原因,主要是隨著細胞衰老,新陳代謝效率降低所致[16]。超過這個時間段不再生產或少量生產該酶,隨時間增長,發(fā)酵液中酶濃度不斷下降,在一定程度上影響酶活的大小[16]。因此,收獲酶的最佳時間為108 h。

圖2　CDA酶合成過程曲線Fig.2　The synthesis curve of CDA

2.4發(fā)酵培養(yǎng)基成分對產酶的影響

2.4.1碳源種類的影響不同菌種所產生的胞外酶不同,故對不同種類碳源的吸收利用亦不相同。實驗采用5種碳源進行實驗,表3為絲狀真菌利用幾種常見碳源產CDA酶的情況。在單因素條件下,以葡萄糖作為碳源發(fā)酵時酶活最高,為12.42 U/mL,蔗糖和可溶性淀粉次之,乳糖作為碳源時酶活最差。說明葡萄糖是菌株產酶的最合適碳源。

2.4.2碳源濃度的影響葡萄糖濃度為零時,只有膠體幾丁質為碳源來源,酶活因細胞饑餓而成倍增加,酶活較高,為13.15 U/mL。根據碳分解代謝物阻遏(carbon catabolite repression,CCR)效應[17],當供應低劑量葡萄糖時,它能阻遏或者關閉用于其它碳源代謝的基因[18],酶活一定程度下降。在葡萄糖濃度為6.5 g/L時,細胞生長與葡萄糖效應達到一個最佳平衡,酶活達到最高,為14.61 U/mL,超過6.5 g/L濃度后酶活呈下降趨勢。因此,葡萄糖在低濃度下影響細胞生長,在高濃度下,則存在葡萄糖效應達,二者均影響CDA的合成。實驗表明,葡萄糖最佳濃度為6.5 g/L,其CDA活性最高。

表3　不同碳源對胞外酶活和細胞濕重的影響

圖3　葡萄糖濃度對胞外酶活的影響Fig.3　Effect of glucose concentration on extracellular enzyme activity

2.4.3氮源種類的影響實驗表明,相同培養(yǎng)條件下,由于有機氮源營養(yǎng)豐富,直接含有少量的游離氨基酸和生長因子[10],有利于菌體的生長,酶活明顯優(yōu)于無機氮源。由表4可以看出,酵母浸膏作為氮源時酶活最高,為17.72 U/mL,牛肉膏次之,無機氮源不利于菌體產酶。因此,最適合菌株發(fā)酵產酶的氮源是酵母浸膏。

2.4.4氮源濃度的影響圖4表明,隨著酵母浸膏濃度的增加,酶活呈現增長趨勢,當濃度達到10 g/L,酶活趨于平穩(wěn)。隨著酵母浸膏濃度增加,酶活趨于飽和。故酵母浸膏濃度為10 g/L時最佳。

圖4　酵母浸膏濃度對胞外酶活的影響Fig.4　Effect of yeast extract concentrationon on extracellular enzyme activity

2.4.5無機鹽種類的影響無機鹽的除了提供除碳、氮以外的各類重要元素外,對微生物菌體的生長、酶的生成、酶活性的激活等有重要影響。實驗表明,在相同培養(yǎng)條件下,鈣離子對酶活的影響程度最高,酶活為14.61 U/mL。詳見表5。

表4　不同氮源對胞外酶活和細胞濕重的影響

表5　不同無機鹽對胞外酶活和細胞濕重的影響

2.4.6無機鹽濃度的影響圖5表明,隨著氯化鈣濃度的增加,該絲狀真菌的酶活開始增加較為迅速,到濃度為0.75 g/L以后,酶活出現緩慢下降,酶活最高可達14.61 U/mL,故氯化鈣濃度為0.75 g/L時最佳。

圖5　氯化鈣濃度對胞外酶活的影響Fig.5　Effect of CaCl2 concentration on extracellular enzyme activity

2.4.7幾丁質濃度的影響幾丁質脫乙酰酶是誘導酶[1],因此幾丁質作為幾丁質脫乙酰酶的作用底物,在培養(yǎng)基中添加一定量的膠體幾丁質將有利于幾丁質脫乙酰酶的合成。圖6表明,隨著幾丁質濃度的增加,菌株的酶活開始增加較為迅速,到濃度為1.25 g/L以后,酶活趨于平穩(wěn),隨后變化幅度不大,趨于飽和,最佳酶活達12.42 U/mL。結果表明,幾丁質最佳添加量為1.25 g/L。

圖6　幾丁質濃度對胞外酶活的影響Fig.6　Effect of chitin concentration on extracellular enzyme activity

2.4.8滲透壓的影響滲透壓對真菌細胞生命活動的進行有較大的影響。本實驗通過NaCl來改變培養(yǎng)基的滲透壓。由于該絲狀真菌是從海口東寨港紅樹林的土里篩選出來的海洋微生物,實驗表明,制作培養(yǎng)基時選用NaCl濃度為1.4%為佳。詳見圖7。

圖7　不同氯化鈉濃度對胞外酶活的影響Fig.7　Effect of NaCl concentration on extracellular enzyme activity

2.5發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交實驗

四因素三水平正交實驗的結果如表6所示。

根據極差Rj的大小,可以判斷各因素對實驗指標的影響力程度。由RD>RC>RB>RA可得出D因素影響力最大,即幾丁質濃度這個因素影響最大。其次是氯化鈣濃度和酵母浸膏濃度,而葡萄糖濃度的影響較小。

根據極差分析,可得出A3B1C2D2為本實驗的最優(yōu)水平組合,即發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳成分組合為葡萄糖濃度7 g/L,酵母浸膏濃度7 g/L,氯化鈣濃度0.75 g/L,幾丁質濃度1.25 g/L。

2.6培養(yǎng)條件對產酶的影響

2.6.1起始pH的影響培養(yǎng)基的pH大小會影響細胞膜所帶的電荷,從而影響細胞對營養(yǎng)物質的吸收,或直接影響酶的活性,進而影響細胞的生長和繁殖,所以在發(fā)酵過程中需要維持一定的pH以維持微生物的正常代謝[19]。圖8表明,菌株在pH為6.0時,CDA酶活達到最高值16.07 U/mL,pH在5.0～6.0之間時酶活迅速上升,超過6.0之后,酶活開始下降。分析原因,pH大于6.0時不適合CDA酶促反應的發(fā)生,酶的穩(wěn)定性下降[10]。發(fā)酵培養(yǎng)時最適pH為6.0。

表6　正交實驗結果極差分析

圖8　起始pH對胞外酶活的影響Fig.8　Effect of initial pH on extracellular enzyme activity

2.6.2發(fā)酵溫度的影響培養(yǎng)溫度能夠顯著影響微生物的生長速率和代謝途徑,不適宜的培養(yǎng)溫度會影響生物體內的活性,從而影響酶的合成[20]。圖9表明,在30 ℃時,幾丁質脫乙酰酶酶活達到最高,為17.53 U/mL,發(fā)酵溫度選擇30 ℃時最佳。

圖9　發(fā)酵溫度對胞外酶活的影響Fig.9　Effect of fermentation temperature on extracellular enzyme activity

2.7條件優(yōu)化后的發(fā)酵進程

在各項條件進行優(yōu)化后,選取最佳組合對該絲狀真菌進行發(fā)酵培養(yǎng),得到結果如圖10,即最高酶活為21.37 U/mL,此時細胞濕重為30.92 g/L。

圖10　條件優(yōu)化后的發(fā)酵進程Fig.10　The fermentation processafter optimization of conditions

3　小結與討論

通過生長曲線的繪制、發(fā)酵培養(yǎng)基成分單因素實驗、發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交實驗、培養(yǎng)條件單因素實驗,考察各因素對幾丁質脫乙酰酶活性的影響,最終得出該絲狀真菌的最佳發(fā)酵條件:NaCl濃度為1.4%、葡萄糖濃度7 g/L、酵母浸膏濃度7 g/L、氯化鈣濃度0.75 g/L、幾丁質濃度1.25 g/L、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH6.00,發(fā)酵溫度為30 ℃,最佳產酶時間為108 h。在此發(fā)酵條件下菌株所產幾丁質脫乙酰酶的最高胞外酶活值為21.37 U/mL。

幾丁質脫乙酰酶作為一種清潔的轉化殼聚糖的工具,具有非常廣闊的前景,但目前尚未脫離實驗室投入生產。實驗對一株能產幾丁質脫乙酰酶絲狀真菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究,得出該菌的最佳培養(yǎng)條件,但是,本課題還存在亟待思考的問題。

其一,天然存在的幾丁質并非幾丁質脫乙酰酶的良好底物,需要使用濃鹽酸將其溶解,才能保證其與酶良好接觸進行反應。強酸的應用違背幾丁質脫乙酰酶法制備殼聚糖防止污染的理念,如何使天然幾丁質更容易與酶結合是一個問題。

其二,與眾多參考文獻比較,該絲狀真菌的產酶能力在篩選出的天然菌株中處于中上水平,與經誘變等處理后的菌株相比還有很大差距,故筆者認為采用基因工程、誘變育種等手段進一步提升該菌種的產酶能力可作為下一步的研究方向。

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Optimization of fermentation conditions of a strain of filamentous fungus producing chitin deacetylase

YING Cong-ping,WANG Yao,LI Yong-cheng*

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

The optimum media composition and fermentation conditions were studied for chitin deacetylase(CDA)production by a screened marine filamentous fungus. Using single factor method and orthogonal experiment in test,the best culture conditions of enzyme was obtained as followings:cultured for 108 h at pH 6.0,and 30 ℃,,the media consist of glucose 7 g/L,yeast extract 7 g/L,CaCl20.75 g/L,chitin 1.25 g/L and NaCl 1.4%. Moreover,after the determination of enzyme activity,it was found that the marine filamentous fungus mainly produced extracellular enzyme. Under this condition of the fermentation,the highest chitin deacetylase activity reached 21.37 U/mL. In general,it was a chitin deacetylase producing strain that had the potential to carry out research further.

Chitin;chitosan;chitin deacetylase

2015-05-19

李永成(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：生物化工，E-mail:lyc2360@sina.com。

應聰萍(1993-)，女，本科，研究方向：食品質量與安全，E-mail:yingcongping2327@163.com。

十二五國家科技支撐計劃項(2012BAD2B06)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000