陶佳妮,李　赟,姚　娣,沈汪洋,2,*,陳　軒,周　堅(jiān),2

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430023)

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咖啡豆α-半乳糖苷酶的同源建模及分析

陶佳妮1,李赟1,姚娣1,沈汪洋1,2,*,陳軒1,周堅(jiān)1,2

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430023)

為進(jìn)一步了解咖啡豆α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu),對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了理論分析和預(yù)測,并在三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行同源建模研究。分析表明,該酶呈酸性,親水,穩(wěn)定。二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主,其空間結(jié)構(gòu)與大米α-半乳糖苷酶相似度較高,以此為模版構(gòu)建了可靠的三維結(jié)構(gòu)模型。模型的一側(cè)是由8個(gè)α-螺旋和8個(gè)β-轉(zhuǎn)角形成的球狀結(jié)構(gòu),另一側(cè)是8個(gè)β-轉(zhuǎn)角。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為咖啡豆α-半乳糖苷酶的空間結(jié)構(gòu)和催化活性位點(diǎn)的研究提供了理論依據(jù)。

咖啡豆α-半乳糖苷酶,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,同源建模

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,EC 3.2.1.22)是一種外切糖苷酶,主要作用對(duì)象是具有α-半乳糖苷結(jié)構(gòu)的碳水化合物。該酶廣泛存在于植物、動(dòng)物及微生物中[1-5],應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域?？Х榷功?半乳糖苷酶是α-半乳糖苷酶的一種,來源于咖啡豆[6-7],咖啡豆α-半乳糖苷酶能夠?qū)肴樘擒罩苯咏又Φ侥阁w環(huán)糊精上,使之成為帶有特殊識(shí)別糖基的環(huán)糊精衍生物,具有特殊的作用[8-12]。但對(duì)該酶在合成反應(yīng)中的活性位點(diǎn)和空間結(jié)構(gòu)的認(rèn)知很有限。對(duì)咖啡豆來源的α-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)研究不夠深入。

目前在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中α-半乳糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)共有40個(gè),尚未發(fā)現(xiàn)咖啡豆α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)模型。因此,有必要對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。同源建模是基于序列-結(jié)構(gòu)相似性原則,通過模板蛋白質(zhì)構(gòu)建待測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)序列的一致性大于30%,便可以利用模板蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來建立靶蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)[13-18]。同源建模原理基于兩點(diǎn):蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)由其氨基酸序列唯一決定;蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中更穩(wěn)定,結(jié)構(gòu)變化比序列變化要慢得多。因此在序列一致性較高的情況下同源建模可以比較準(zhǔn)確的預(yù)測一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型。王海波等[19]采用同源建模法構(gòu)建了紫花苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶mPDI的三維結(jié)構(gòu),張遠(yuǎn)等[20]構(gòu)建了嗜冷黃桿菌?；?Acp去飽和酶的三維結(jié)構(gòu),趙斌等[21]構(gòu)建了擬南芥轉(zhuǎn)酮醇酶蛋白AtTKL1的三維結(jié)構(gòu)。

本文通過應(yīng)用多種生物信息學(xué)原理對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測和分析,并構(gòu)建了咖啡豆α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)模型,為咖啡豆α-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

咖啡豆α-半乳糖苷酶序列來自歐洲生物信息學(xué)研究所(SWISS-PROT)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/),檢索序列號(hào)(AC)為:Q42656。咖啡豆α-半乳糖苷酶的氨基酸序列見圖5。

同源建模軟件MODELLER9.14[22];分子三維結(jié)構(gòu)顯示軟件PyMOL1.7[23]。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1咖啡豆α-半乳糖苷酶一級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用瑞士生物信息學(xué)研究所提供的ProtParam程序(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的相對(duì)分子量、氨基酸殘基數(shù)目、組成、蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)及疏水性平均值等參數(shù)進(jìn)行分析。

采用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的疏水性進(jìn)行分析。

采用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測。

采用SignalP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP/)對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測。

采用PSORT Prediction(http://psort.hgc.jp/form.html)對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶進(jìn)行細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。

采用ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.2.2咖啡豆α-半乳糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)以及無規(guī)則卷曲等進(jìn)行分析預(yù)測。

1.2.3咖啡豆α-半乳糖苷酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測采用NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins)進(jìn)行序列搜尋和比對(duì),選出模版蛋白質(zhì)。

使用專業(yè)同源建模軟件MODELLER9.14來構(gòu)建咖啡豆α-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)模型,采用molpdf,DOPE score,GA341 score三種評(píng)估方法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估[24]。

使用PyMOL軟件展示咖啡豆α-半乳糖苷酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.2.4咖啡豆α-半乳糖苷酶三級(jí)結(jié)構(gòu)評(píng)估采用Procheck、ERRAT和Verify_3D(http://nihserver. mbi.ucla.edu/SAVES/)對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評(píng)估。

2　結(jié)果與討論

2.1咖啡豆α-半乳糖苷酶一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

咖啡豆α-半乳糖苷酶由378個(gè)氨基酸組成,分子量為41.31 kDa,其分子式為C1819H2804N500O568S17,計(jì)算得到的原子總數(shù)為5708,等電點(diǎn)為5.60。酸性氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為43,堿性氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為37,因此咖啡豆α-半乳糖苷酶為酸性。疏水性的總平均值(GRAVY)為-0.413,為負(fù)值,該酶為親水性。不穩(wěn)定指數(shù)(II)為30.11,根據(jù)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)在40以下為穩(wěn)定蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn),該酶較為穩(wěn)定。脂肪族氨基酸指數(shù)為71.80。該酶N端為M(Met)。組成咖啡豆α-半乳糖苷酶的氨基酸比例見表1,其中絲氨酸的含量最高為9.5%,半胱氨酸和組氨酸的含量最低,均為1.6%。

表1　咖啡豆α-半乳糖苷酶的氨基酸組成分析

對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的疏水性分析見圖1,正值越大表示疏水性越強(qiáng),負(fù)值越大表示親水性越強(qiáng)。根據(jù)SAPS的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,該酶的疏水性氨基酸數(shù)目為124個(gè),親水性氨基酸數(shù)目為254個(gè)。146～148區(qū)域具有較強(qiáng)的親水性,其中147號(hào)氨基酸的親水性最強(qiáng);256～258區(qū)域具有較強(qiáng)的親水性,其中257號(hào)氨基酸的親水性最強(qiáng)。

圖1　咖啡豆α-半乳糖苷酶的疏水性氨基酸分布圖Fig.1　The distribution of hydrophobic amino acidsin coffee-bean α-galactosidase

對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的跨膜區(qū)域的預(yù)測見圖2,圖中縱坐標(biāo)為概率,橫坐標(biāo)為氨基酸序列。從圖中看,d線的縱坐標(biāo)數(shù)值極低,即該酶中存在跨膜區(qū)域的概率極低,c線的縱坐標(biāo)數(shù)值很低,即氨基酸在膜內(nèi)的概率很低,b線的縱坐標(biāo)數(shù)值很高,接近于1,即氨基酸在膜外的概率很高。同時(shí)依據(jù)圖中左上方數(shù)值顯示,該酶在跨膜區(qū)域中的氨基酸序列期望值為0.05234,存在跨膜區(qū)域時(shí)該數(shù)值應(yīng)大于18[25]。因此該酶沒有跨膜區(qū)域,378個(gè)氨基酸殘基全部在膜外。

圖2　咖啡豆α-半乳糖苷酶跨膜區(qū)域預(yù)測Fig.2　Transmembrane regional prediction of coffee-bean α-galactosidase注:a:N-best算法的顯示線,b:在膜外的概率線,c:在膜內(nèi)的概率線,d:可能出現(xiàn)跨膜區(qū)域。

對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測,一般來講,信號(hào)肽在蛋白質(zhì)N端,很少超過45個(gè)氨基酸殘基,所以N端的序列對(duì)信號(hào)肽的分析預(yù)測具有重要作用[26]。在此分析了N端的70個(gè)氨基酸,每個(gè)氨基酸分別對(duì)應(yīng)一個(gè)S、C、Y值。圖3中略有波動(dòng)的線為S值,若存在信號(hào)肽區(qū)域,其值會(huì)較高。下方一排豎線為C值,若存在剪切位點(diǎn),C值會(huì)較高。趨近于水平的線為Y值,Y-max是綜合考慮S值和C值的一個(gè)參數(shù),比單獨(dú)考慮C值更精確。圖3中可清晰的看出,S值較平緩,C值基本無變化,Y值趨近于水平,由此,該咖啡豆α-半乳糖苷酶不存在信號(hào)肽。

圖3　咖啡豆α-半乳糖苷酶信號(hào)肽預(yù)測Fig.3　Signal peptide prediction of coffee-bean α-galactosidase注:S:跨膜區(qū)域,C:剪切位點(diǎn),Y:綜合參數(shù)。

2.2咖啡豆α-半乳糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA服務(wù)器對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在該酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)中:α-螺旋結(jié)構(gòu)(Alpha helix,h)為33.60%,擴(kuò)展長鏈(Extended strand,e)為21.69%,β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(Beta turn,t)為8.47%,無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(Random coil,c)為36.24%。α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)交替存在,是該酶整體結(jié)構(gòu)中的主要組成構(gòu)件,擴(kuò)展長鏈均勻的分布在整條鏈中。這種分布有利于該酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。見圖4。

圖4　咖啡豆α-半乳糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4　Secondary structure prediction of coffee-bean α-galactosidase注:h:α-螺旋,e:擴(kuò)展長鏈,t:β-轉(zhuǎn)角,c:無規(guī)則卷曲。

2.3咖啡豆α-半乳糖苷酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.1選擇模版以咖啡豆α-半乳糖苷酶的氨基酸序列作為查詢序列,使用NCBI提供的BLAST程序進(jìn)行序列搜尋和比對(duì),得到與其最接近的1UAS的序列。結(jié)果顯示,同源率(所比對(duì)序列與目標(biāo)序列的相似度)為73%,覆蓋率(所比對(duì)序列與目標(biāo)序列的重疊度)為95%,E期望值(造成這一比對(duì)結(jié)果的隨機(jī)概率)為0。1UAS是大米α-半乳糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu),包含362個(gè)氨基酸[27],大米α-半乳糖苷酶與咖啡豆α-半乳糖苷酶具有較好的序列一致性,故選取1UAS作為模板蛋白質(zhì)。

2.3.2同源建模將咖啡豆α-半乳糖苷酶的氨基酸序列錄入MODELLER的腳本文件target.ali,見圖5。使用腳本文件01_align.py對(duì)靶序列咖啡豆α-半乳糖苷酶與模板序列1UAS進(jìn)行疊合。使用腳本文件02_model.py,以1UAS為模版,對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶進(jìn)行建模。采用molpdf,DOPE score,GA341 score三種評(píng)估方法對(duì)構(gòu)建的5個(gè)模型進(jìn)行評(píng)估,見圖6。

圖5　咖啡豆α-半乳糖苷酶的氨基酸序列Fig.5　Amino acid sequence of coffee-bean α-galactosidase

圖6　模型的評(píng)估Fig.6　Evaluate models of coffee-bean α-galactosidase

molpdf與DOPE score的值越低越理想。GA341 score的值在1附近,則說明模型合理,其值越高越理想[24]。選出最優(yōu)結(jié)構(gòu)模型targ.1.pdb,經(jīng)PyMOL軟件展示,見圖7?？Х榷功?半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)模型包含8個(gè)α-螺旋,16個(gè)β-轉(zhuǎn)角。8個(gè)α-螺旋位于結(jié)構(gòu)的一側(cè),形成一個(gè)球狀結(jié)構(gòu),8個(gè)β-轉(zhuǎn)角相互平行,位于8個(gè)α-螺旋形成球面的內(nèi)部,8個(gè)β-轉(zhuǎn)角位于結(jié)構(gòu)的另一側(cè)。

圖7　咖啡豆α-半乳糖苷酶的同源模型結(jié)構(gòu)Fig.7　Homology modelfor coffee-bean α-galactosidase

2.4咖啡豆α-半乳糖苷酶三級(jí)結(jié)構(gòu)評(píng)估

使用Procheck、Verify3D和ERRAT分別對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶同源模型結(jié)構(gòu)targ.1從三個(gè)方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

Procheck程序主要用于評(píng)價(jià)模型中殘基與殘基之間的立體化學(xué)性質(zhì),用圖8中的拉氏構(gòu)象圖(Ramachandran)來表示。其中89.8%的氨基酸處于最適區(qū),7.2%處于較合適區(qū),1.2%處于可接受區(qū),1.8%處于不合理區(qū)。由此可見,98.2%的氨基酸殘基分布在合理區(qū)域,說明模型結(jié)構(gòu)合理。

圖8　Targ.1的Procheck評(píng)價(jià)Fig.8　Procheck analysis of targ.1注:A、B、L為合理區(qū);a、b、l、P為較合理區(qū);～a、～b、～l、～P為大體可接受區(qū);其余為不合理區(qū)。

Verify3D是用于分析三維結(jié)構(gòu)(3D)與一級(jí)序列(1D)兼容性的程序。應(yīng)用Verify3D對(duì)targ.1模型進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果表明至少有80%的氨基酸殘基3D-1D的相容性分值大于0.2,說明這個(gè)模型通過了Verify3D檢測。

ERRAT是通過統(tǒng)計(jì)模型結(jié)構(gòu)中不同原子間非鍵相互作用,與高分辨率晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)相比較,其誤差值在置信區(qū)間內(nèi)的區(qū)域被認(rèn)為是合理區(qū)域,合理區(qū)域所占的百分比越高說明結(jié)構(gòu)質(zhì)量越高。圖9中ERRAT計(jì)算的模型結(jié)構(gòu)的百分比為85.13%,說明該模型結(jié)構(gòu)具有可靠性。

圖9　Targ.1的ERRAT評(píng)價(jià)Fig.9　ERRAT analysis of targ.1

3　結(jié)論

對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。分析一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),其主肽鏈由378個(gè)氨基酸組成,理論等電點(diǎn)為5.60,酸性和堿性氨基酸殘基總數(shù)分別為43和37,為酸性。疏水性的總平均值(GRAVY)為-0.413,不穩(wěn)定指數(shù)(II)為30.11,水溶性穩(wěn)定。無跨膜區(qū)域和信號(hào)肽。包含一個(gè)由17個(gè)氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域。分析二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),主要構(gòu)件為α-螺旋和無規(guī)則卷曲。以大米α-半乳糖苷酶作為模板,對(duì)咖啡豆α-半乳糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。模型包含8個(gè)α-螺旋和16個(gè)β-轉(zhuǎn)角,綜合評(píng)價(jià)表明其符合立體化學(xué)規(guī)則,建模結(jié)構(gòu)合理?？勺鳛榉肿訉?duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬的基礎(chǔ),同時(shí)也可為該酶的空間結(jié)構(gòu)和催化活性位點(diǎn)研究提供諸多信息。

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[22]N. Eswar,M. A. Marti-Renom,B. Webb,M. S. Madhusudhan,D. Eramian,M. Shen,U. Pieper,A. Sali. Comparative Protein Structure Modeling With MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics,John Wiley & Sons,Inc.,Supplement 15,2006,

5.6.1-5.6.30. Modeller 9.14(http://salilab.org/modeller/)

[23]M.A. Marti-Renom,A. Stuart,A. Fiser,R. Sánchez,F. Melo,A. Sali. Comparative protein structure modeling of genes and genomes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.2000,29,291-325. pymol1.7(http://www.pymol.org/)

[24][EB/OL]http://salilab.org/modeller/tutorial/basic.html 2015/6/5

[25][EB/OL]http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/TMHMM2.0.guide.html#output 2015/6/5

[26]Blobel G,Walter P,Chang C N,et al. Translocation of proteins across membranes:the signal hypothesis and beyond[J]. Symposia of the Society for Experimental Biology,1979,33:9-36.

[27][DB/OL]http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1UAS2015/6/5.

Analysis and homology modeling of Coffee-beanα-Galactosidase

TAO Jia-ni1,LI Yun1,YAO Di1,SHEN Wang-yang1,2,*,CHEN Xuan1,ZHOU Jian1,2

(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products,Wuhan 430023,China)

The primary and spatial structures of coffee-beanα-galactosidase were studied to further determine its structure and function. The results showed that the enzyme protein was hydrophilic,acidic and stable. The secondary structure was dominated byα-helices and random coils. The three-dimensional structures of coffee-beanα-galactosidase were constructed based on the template of riceα-galactosidase by homology modeling because their spatial structures were similarity.The side of the structure model was 8α-helices and 8β-turns,and the other was 8β-turns. The experimental results provided the theoretical basis for the study on the spatial structure and catalytic site of coffee-beanα-galactosidase.

coffee-beanα-galactosidase;protein structure analysis;homology modeling

2015-05-15

陶佳妮(1991-)，女，碩士，研究方向：食品生物化學(xué)，E-mail：18671272080@163.com。

沈汪洋(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物化學(xué)，E-mail：whwangyangshen@126.com。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31301415)。

TS201.7

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000