李寶權(quán)，李曉光，鐘莉莉

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 骨二科，黑龍江 齊齊哈爾161000； 2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 研究中心)

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BMSc細(xì)胞的粘附及增殖與鈦絲直徑關(guān)系的研究

李寶權(quán)1*，李曉光1，鐘莉莉2

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 骨二科，黑龍江 齊齊哈爾161000； 2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 研究中心)

目的比較兩種不同直徑的鈦金屬纖維絲(50、90 μm)在體外與細(xì)胞的粘附能力。并確定哪種鈦金屬纖維絲與細(xì)胞粘附能力較好。方法抽取兔骨髓，用密度梯度離心法分離兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSc)，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并傳代，傳至3代后，分別接種在兩種不同直徑的鈦纖維絲上，然后通過掃描電鏡觀察鈦纖維絲表面細(xì)胞粘附情況，對照組為單純細(xì)胞組。Cell Counting Kit-8檢測，即在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇450 nm波長測定各孔光吸收值并記錄結(jié)果。吖啶橙熒光法在熒光顯微鏡下觀察兩種不同直徑鈦纖維絲上的細(xì)胞粘附情況，并評價兩種不同直徑鈦纖維絲的粘附指標(biāo)。結(jié)果掃描電鏡觀察結(jié)果：90 μm直徑鈦纖維絲上的細(xì)胞粘附數(shù)量與50 μm直徑的鈦纖維絲上粘附細(xì)胞形態(tài)良好，片狀生長彼此連接緊密，與鈦纖維絲粘附緊密。cck-8所檢測的結(jié)果：50 μm直徑鈦纖維絲組在開始階段細(xì)胞粘附率要高于90 μm直徑鈦纖維絲組，但隨著時間的進(jìn)程90 μm直徑鈦纖維絲組細(xì)胞粘附率要更好，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。吖啶橙染色結(jié)果：熒光照相結(jié)果顯示48小時后粘附在90 μm直徑鈦纖維絲上的細(xì)胞數(shù)量要高于粘附在50 μm直徑鈦纖維絲上的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)論90 μm直徑的鈦纖維絲的粘附性要優(yōu)于50 μm直徑的鈦纖維絲，對細(xì)胞的增殖無明顯影響。

鈦纖維；BMSc細(xì)胞；細(xì)胞粘附

(ChinJLabDiagn,2016,20:1270)

現(xiàn)今，隨著組織工程及細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞粘附于各種支架材料的研究，已經(jīng)取得了可觀的成果。雖然可供選擇生物材料眾多，但仍以鈦金屬為最佳材料。鈦金屬現(xiàn)已被公認(rèn)為組織相容性最好的生物材料。各種形態(tài)的鈦金屬被應(yīng)用于內(nèi)固定及外固定，同時也廣泛用于骨缺損及骨組織工程領(lǐng)域。鈦金屬材料由于其良好的力學(xué)性能和可加工性，在替代與修補(bǔ)人體硬組織方面占有重要地位，其中鈦及鈦合金又因極佳的生物相容性和良好的耐腐蝕性受到特別重視，已被廣泛應(yīng)用于骨外科。尤其骨缺損是臨床上經(jīng)常遇到的問題，目前常用的方法是植骨術(shù)。大多都是以自體骨植入為主。顆粒骨是目前臨床較常用的植骨方法。為增加植骨強(qiáng)度可將不同生物材料植入其中。本實驗就是應(yīng)用鈦纖維絲為生物內(nèi)支架材料，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)將種子細(xì)胞擴(kuò)增并和鈦纖維絲復(fù)合培養(yǎng)，探討細(xì)胞與鈦纖維絲之間的增殖及粘附情況，從而得出相應(yīng)的數(shù)據(jù)及結(jié)論，為鈦纖維絲進(jìn)一步應(yīng)該于體內(nèi)進(jìn)行骨缺損實驗提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物及材料

2個月齡新西蘭大白兔2只，雌雄不限，體量2.5-3.0 kg。 鈦纖維絲 直徑50 μm、90 μm長度為5 mm，每組200根。

1.2藥品與試劑

DMEM F-12培養(yǎng)基、Procoll分離液(Pharmacia)、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Hyclone)、青鏈霉素混合液(Solarbio)、胰蛋白酶(Solarbio)、Cell Counting Kit(CCK-8試劑盒 )、PBS緩沖液(Solarbio)、吖啶橙(Sigma)、戊二醛溶液。

1.3主要儀器

動物實驗手術(shù)器械；掃描電鏡(S-N3400型)；高速離心機(jī)；全自動酶標(biāo)儀(WD-9417B型)；熒光顯微鏡。

1.4方法

1.4.1兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉大白兔，穿刺髂骨骨髓血(含肝素)，與Hanks液1∶1混勻，800 r/min離心5 min去脂。用DMEM沖洗，反復(fù)幾次，將此沖洗液緩慢加入含有percoll(密度1.073)的10 ml離心管中，1 500 r/min離心15 min，取界面細(xì)胞，用DMEM反復(fù)洗滌細(xì)胞2次，離心收集細(xì)胞。用含10%胎牛血清的DMEM吹打細(xì)胞成單個細(xì)胞懸液并接種于50 ml培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。72 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，未貼壁細(xì)胞經(jīng)反復(fù)換液去除，待集落形成，細(xì)胞生長至80%融合后傳代。傳代培養(yǎng)時加入0.25%胰酶消化，相差顯微鏡下觀察長梭形BMSc變圓，傾去消化液，加入培養(yǎng)基，并吹打分散細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，以1×104Pml密度接種于50 ml的培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到90%以上時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第三代經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，備用。

1.4.2BMSc與兩種不同直徑的鈦纖維絲共培養(yǎng)及粘附檢測 將傳至三代的BMSc消化成細(xì)胞懸液待用。鈦纖維絲高溫消毒后，以每組200根數(shù)量平鋪于6孔板內(nèi)。再以每孔1×104個細(xì)胞(1ml)分別接種于兩種不同直徑的(50 μm和90 μm)鈦纖維絲中。細(xì)胞孵箱中孵育48 h后，以25%戊二醛固定，4℃冰箱過夜行電鏡掃描觀察。將三代BMSc消化成細(xì)胞懸液待用。將鈦纖維絲以每組200根數(shù)量平鋪于24孔板中，分三組，對照組(細(xì)胞組)，實驗組(50 μm和90 μm組)。將細(xì)胞以10×4個細(xì)胞(1 ml)分別接種于24孔板中。分別在6、12、24、36、48 h，不同時間點(diǎn)以胰酶消化鈦纖維絲上的細(xì)胞并收集，分別測得6、12、24、36、48 h酶標(biāo)儀在紫外吸收光度450 nm測量細(xì)胞生長及粘附情況。將三代BMSc以1×104個細(xì)胞(1 ml)在96板中與實驗組鈦纖維絲培養(yǎng)48 h后，分組消化細(xì)胞，加入吖啶橙熒光染料，加入染料1 min后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS軟件包處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P值<0.05為有顯著差異。

2　結(jié)果

2.1掃描電鏡結(jié)果

BMSc在兩種直徑的鈦纖維絲上培養(yǎng)48 h后，做掃描電鏡觀察(圖1)。發(fā)現(xiàn)50 μm、90 μm直徑的鈦纖維絲組上的細(xì)胞成片生長，細(xì)胞彼此連接，90 μm粘附性更好。

A:電鏡下50 μm 直徑的鈦纖維絲組上的細(xì)胞 B:電鏡下90 μm 直徑的鈦纖維絲組上的細(xì)胞

圖1BMSc在兩種直徑的鈦纖維絲做掃描電鏡

2.2CCK-8檢測結(jié)果

對照組(以下簡稱細(xì)胞組)與實驗組(50 μm鈦纖維絲組與90 μm鈦纖維絲組)所測OD值450，三組細(xì)胞增殖速度差異并不明顯，50 μm直徑鈦纖維絲組在開始階段細(xì)胞粘附率要高于90 μm直徑鈦纖維絲組，但隨著時間的進(jìn)程90 μm直徑鈦纖維絲組細(xì)胞粘附率要更好(表1)。粘附率公式:[OD450(粘附細(xì)胞)/OD450(總細(xì)胞)×100%] /鈦纖維絲表面積50 μm直徑鈦纖維絲組與90 μm直徑鈦纖維絲組比較P<0.05

表1　CCK-8測定BMSc在兩種不同直徑鈦纖維絲表面細(xì)胞粘附率

2.3吖啶橙熒光染色結(jié)果

吖啶橙(AO)能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞均呈均勻一致的圓狀結(jié)構(gòu)，發(fā)出明亮的綠色熒光，表明細(xì)胞未凋亡，屬正常存活細(xì)胞。實驗組兩組不同直徑的鈦纖維絲上消化下來的細(xì)胞肉眼可見有明顯的數(shù)量差異。48 h后90 μm直徑鈦纖維絲粘附的細(xì)胞數(shù)量顯著多于50 μm直徑鈦纖維絲上的細(xì)胞數(shù)量 (圖2)。

A:吖啶橙熒光染色下50 μm 直徑的鈦纖維絲組上的細(xì)胞 B:吖啶橙熒光染色電鏡下90 μm 直徑的鈦纖維絲組上的細(xì)胞

圖2BMSc在兩種直徑的鈦纖維絲做吖啶橙熒光染色

3　討論

3.1鈦金屬作為理想的支架材料，其形態(tài)的變化對細(xì)胞粘附影響較大

不同形態(tài)的鈦金屬因其表面形態(tài)各異，因此對細(xì)胞的粘附有著一定的影響。鄧天燕[1]等人用不同表面形態(tài)的鈦金屬片在體外對小鼠成骨干細(xì)胞的粘附做了相關(guān)研究。研究表明鈦金屬表面形態(tài)的變化對細(xì)胞的粘附有著顯著的影響。近年來有很多學(xué)者開始對鈦纖維復(fù)合材料產(chǎn)生了濃厚的興趣，并且進(jìn)行了深入的研究。研究發(fā)現(xiàn)[2]碳纖維是“惰性、無毒性”生物材料，但是碳纖維因其降解性能較差的特性，并非是理想的組織工程支架材料。又有研究表明[3]，用適量的金屬纖維絲增強(qiáng)生物復(fù)合材料的機(jī)械性能，對人體受力較大的部位的骨缺損的填補(bǔ)移植獲得了令人滿意的成效。而鈦纖維作為骨內(nèi)植入體和硬組織材料在臨床及基礎(chǔ)研究上受到了廣泛關(guān)注。L.D Timmie Topoleski[4，5]等人發(fā)現(xiàn)，以鈦纖維絲增強(qiáng)的生物材料的力學(xué)性能可以提高10%以上。鈦及鈦合金具有較低的密度、較好的生物相容性，在臨床應(yīng)用廣泛。實驗證明[6]鈦金屬纖維絲易于骨細(xì)胞的著床、增殖。當(dāng)鈦纖維絲的直徑在100 μm以下時，顯示出更好的親和性。本實驗雖并未表明鈦金屬纖維絲易于骨細(xì)胞的增殖，但對其增殖并無明顯影響，確實易于細(xì)胞的著床，因此可以證明鈦金屬纖維絲確實具有較好的生物相容性，這一形態(tài)有助于組織細(xì)胞的粘附。

3.2實驗材料選擇的依據(jù)

在骨組織工程中種子細(xì)胞的選擇對實驗研究起到了至關(guān)重要的作用。經(jīng)過多年的研究目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSc)是現(xiàn)今骨組織工程中最理想的種子細(xì)胞，因為BMSc是一種具有向著多種細(xì)胞分化潛能的干細(xì)胞[7]。在人體受到外界不同因素刺激時，BMSc在體內(nèi)不同因子的作用下，通過不斷的增殖和分裂能分化成機(jī)體所需要的不同細(xì)胞來修復(fù)受損組織[8]。而在特定的細(xì)胞作用及環(huán)境下可分化為骨、成骨、軟骨、神經(jīng)元、肌肉、脂肪等細(xì)胞，而且易于分離和純化，自體移植等。所以被廣泛認(rèn)為是骨組織工程的種子細(xì)胞的主要來源之一[9]。骨缺損修復(fù)是骨組織工程中難題之一，而做為種子細(xì)胞的BMSc在骨誘導(dǎo)劑的催化下能夠向成骨細(xì)胞分化并具有良好的分泌骨基質(zhì)的能力[10]。因此，本實驗選擇BMSc做為基礎(chǔ)種子細(xì)胞。鈦金屬具有組織相容性好，細(xì)胞毒性小，低彈性模量等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)已應(yīng)用于骨組織工程中的多個領(lǐng)域，在臨床上應(yīng)用也極其廣泛，比如口腔外科、頜面外科、整形外科等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其主要作用是修復(fù)骨缺損，支撐骨的塑形等。因損傷部位及程度不同，鈦金屬以不同的形態(tài)特征被塑造成各種類型的器械及支架材料。鈦纖維做為新型支架材料修復(fù)組織缺損[11,12]取得了一定的實驗成果。尤其是在體外對細(xì)胞的粘附及增殖的影響情況方面的報道近年來已然成為熱點(diǎn)[13]，因此能夠早日將鈦纖維植入體內(nèi)應(yīng)用于臨床是所有志力于此項研究的工作者的共同愿望。基于以上原因我們選擇鈦纖維作為實驗的主要材料。本實驗的目的就是檢測鈦纖維絲在體外與細(xì)胞的粘附及增殖情況，為了進(jìn)一步體內(nèi)實驗提供前期數(shù)據(jù)。

3.3實驗結(jié)果分析

掃描電鏡是一種對表面微觀世界能夠進(jìn)行全面分析的多功能的一種電子光學(xué)儀器。近年來被廣泛應(yīng)用于材料學(xué)，冶金學(xué)，生物醫(yī)學(xué)等多學(xué)科。它可以直接觀察樣品表面的微觀形態(tài)，可以在三度空間里進(jìn)行各個區(qū)域的觀察，并且可以放大數(shù)倍。在接種48小時后，50 μm直徑鈦纖維絲組可見細(xì)胞在鈦纖維絲表面生長，形態(tài)正常，伸展，粘貼緊密?？梢娂?xì)胞與細(xì)胞之間的連接。但是在90 μm直徑鈦纖維絲組可明顯觀察到細(xì)胞伸展較大，與鈦纖維絲表面連接緊密，成片生長，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接較50 μm直徑鈦纖維絲組更加緊密?？傮w來說，50 μm直徑鈦纖維絲組與90 μm直徑鈦纖維絲組的細(xì)胞生長狀態(tài)在掃描電鏡下觀察后者要優(yōu)于前者，不過細(xì)胞生長狀態(tài)均屬正常。這項指標(biāo)結(jié)果顯示了90 μm直徑鈦纖維絲組對細(xì)胞的粘附度更好。Cell Counting Kit(簡稱CCK-8)：是用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、細(xì)胞增殖及粘附試驗、細(xì)胞毒性試驗等。CCK-8結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞生長趨勢改變不是特別明顯，因為對照組起始細(xì)胞種植量為1×104(1 ml)，種入24孔板中經(jīng)過48 h的培養(yǎng)基本已經(jīng)長滿細(xì)胞，所以在6、12、24、36、48 h這五個時間段的生長趨勢并不明顯。對照組主要是為了證明實驗組(50 μm與90 μm組)與對照組的細(xì)胞起始種植量是相等的。主要是測得實驗組兩組之間細(xì)胞的增殖及粘附情況。結(jié)果表明，實驗組兩組細(xì)胞生長及增殖在不同時間點(diǎn)上無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。但是隨著時間的增長粘附細(xì)胞的數(shù)量因為兩組不同直徑的鈦纖維絲表面積不同，細(xì)胞的粘附率呈現(xiàn)出不同的變化，50 μm直徑鈦纖維絲組在開始6小時細(xì)胞粘附率略高于90 μm直徑鈦纖維絲組，其余時間段90 μm直徑鈦纖維絲組的細(xì)胞粘附率要高于50 μm直徑鈦纖維絲組，有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此當(dāng)鈦纖維絲的直徑在100 μm以下時，鈦纖維絲表面積的大小可能決定細(xì)胞粘附率的多少。在不同時間點(diǎn)所消化下來的50 μm直徑鈦纖維絲組與90 μm直徑鈦纖維絲組細(xì)胞經(jīng)過吖啶橙熒光染色，在熒光顯微鏡下可明顯觀察到細(xì)胞的粘附增殖，隨著時間的延長細(xì)胞粘附的數(shù)量呈明顯增加趨勢。但是因為起始細(xì)胞種植量比較大在細(xì)胞與鈦纖維絲接種后的48小時這間細(xì)胞粘附的趨勢不是很明顯，因為細(xì)胞已經(jīng)生長到達(dá)了極限。但仍能發(fā)現(xiàn)90 μm直徑鈦纖維絲組的細(xì)胞粘附優(yōu)于50 μm組，總體來看，90 μm直徑的鈦纖維絲的粘附性要優(yōu)于50 μm直徑的鈦纖維絲，對細(xì)胞的增殖雖為起到推動作用，但卻無明顯的負(fù)面影響，因此，可以選擇90 μm直徑的鈦纖維絲作為體內(nèi)進(jìn)行骨缺損實驗研究的主要材料。

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Different diameter titanium filaments in vitro cell adhesion and proliferation

LI Bao-quan,LI Xiao-guang,ZHONG Li-li.

(DepartmentofOrthopedicsSurgery,QiqiharMedicalCollegeSecondAffiliatedHospital，Qiqihar161000,China)

ObjectiveTo compare two titanium metal fiber filaments of different diameters (50,90 μm) in vitro cell adhesion ability.And to better determine what kind of titanium filaments and cell adhesion capacity.MethodsExtracted rabbit bone marrow,isolated by lymphocyte separation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) cultured and passaged in a petri dish,and spread to three generations,were inoculated with two different diameter titanium filaments,then by scanning electron microscopy titanium fiber filament surface cell adhesion.Cell Counting Kit-8 (CCK-8 kit),i.e.to select a wavelength of 450 nm on the enzyme-linked immunosorbent detector measured the light absorption values of the respective hole,a recording result.Acridine orange fluorescence observed under a fluorescence microscope on the cell adhesion in the two different diameters of titanium fiber filaments and to evaluate the adhesion of the two different diameters titanium filaments indicators.ResultsThe results of scanning electron microscopy results 90 μm diameter titanium fiber wire on the number of cell adhesion is significantly more than the number of cell adhesion 50 μm diameter titanium filaments.90 μm diameter titanium fiber yarn group in the result of the detection by the CCK-8 adhesion was significantly higher than the group of 50 μm diameter titanium fiber filaments.The statistical analysis meaningful (P<0.05).Acridine orange staining showed adhesion 90 μm diameter titanium fiber filaments on the number of cells was significantly higher than the number of cells adhered 50 μm diameter titanium fiber filaments.Conclusion90 μm diameter titanium filaments adhesion superior to 50 μm diameter titanium fiber filaments.

Titanium fiber;Mesenchymal Stem Cells in the bone marrow;Cell Adhesion

齊齊哈爾市科研項目(SFZ0-2013150)

1007-4287(2016)08-1270-04

Q813

A

2015-12-24)