王立娜，馬明珠，王集會

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東濟(jì)南 250355 )

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發(fā)酵土鱉蟲總黃酮含量的測定及方法學(xué)考察

王立娜1，馬明珠1，王集會2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東濟(jì)南 250355 )

[目的]研究發(fā)酵土鱉蟲含水醇提物中總黃酮含量的測定方法，并對其方法學(xué)進(jìn)行考察。[方法]采用NaNO2-AlCl3-NaOH比色法在510 nm處測定黃酮類化合物與顯色劑所形成的絡(luò)合物吸光度。[結(jié)果]所測定標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性良好，r=0.999 0，線性范圍在0.02～0.10 mg/mL，試驗(yàn)方法的精密度RSD=1.92%，重現(xiàn)性RSD=1.23%，樣品回收率95.00%±10.00%，RSD=2.09%。樣品重復(fù)測定總黃酮含量平均值為4.630 8 mg/g。[結(jié)論]方法學(xué)考察結(jié)果表明，用紫外分光光度法測定發(fā)酵土鱉蟲總黃酮類化合物含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性等項(xiàng)內(nèi)容都符合相關(guān)規(guī)定，該方法準(zhǔn)確可靠，可用于含量測定。

發(fā)酵土鱉蟲；黃酮絡(luò)合物；方法學(xué)考察

土鱉又名土元、地鱉，是鱉蠊科昆蟲中華真地鱉(EupolyphagasinensisWalker )和冀地鱉(PolyphagaplancyiBolivar)的雌體。味咸，性寒，有小毒，能入肝、心、脾三經(jīng)，其藥用最早記載于秦漢時(shí)代的《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有活血散瘀，消腫止痛等功效[1]?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)研究充分表明了土鱉蟲能夠抗腫瘤、抗凝血、溶解血栓以及抑制血小板聚集等功效[1]。

白僵菌[Beauveriabassiana(Bals.)Vuill]是一種絲狀真菌，屬于半知菌亞門，在其生長過程中可產(chǎn)生多種次生代謝物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、多糖、白僵菌素、黃酮等，具有一定抗腫瘤活性。白僵菌孢子接觸昆蟲后，在適宜的溫度條件下萌發(fā)，生長菌絲侵入蟲體內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，而蟲類發(fā)酵可以利用微生物在生長過程中產(chǎn)生的強(qiáng)大酶系如蛋白酶糖化酶等將蟲類中藥中所含有的蛋白、多糖、黃酮等成分轉(zhuǎn)化修飾成活性更強(qiáng)的物質(zhì)，從而發(fā)揮更大的藥效，增加有效成分利用率。有學(xué)者從中華真地鱉石油醚部分得到1種黃酮類化合物[2]，而白僵菌在發(fā)酵過程中也會產(chǎn)生較多黃酮，土鱉蟲中所含的黃酮類化合物與白僵菌的生長、代謝存在相互作用，進(jìn)而改變其含量。目前國內(nèi)外對發(fā)酵土鱉蟲黃酮類化合物的研究未見資料報(bào)道。因此該試驗(yàn)以球孢白僵菌為發(fā)酵菌，將其接種在土鱉蟲粉上，采用新型固體雙向發(fā)酵模式對土鱉蟲進(jìn)行深層加工，建立了球孢白僵菌與土鱉蟲二者相互作用后所轉(zhuǎn)化的黃酮類化合物含量測定的紫外分光光度法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，以期為從發(fā)酵土鱉蟲粉中提取黃酮類化合物并加以利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材與試劑。發(fā)酵土鱉蟲粉(山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，批號20150501)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民老師鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉(EupolyphagasinensisWalker)；白僵菌[Beauveriabassiana(Bals.)Vuill]孢子粉(100億/g，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所自篩選菌株——桃 5)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(CHENGDU MUST BIO-TECHNOLOGY CO，LTD.含量≥98.00%，UV)、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、六水氯化鋁、乙醇皆為分析純。

1.1.2儀器。UV9100B型可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；TDZ5-WS臺式多管低速離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司)；FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1發(fā)酵土鱉蟲粉的制備。精密稱取一定量的土鱉蟲干粉，取1.000 0 g白僵菌孢子粉，加少量吐溫-80，用適量滅菌水將其稀釋成為每毫升含1×108個(gè)孢子的混懸液，取適量，拌勻潤濕，25～28 ℃，濕度為95%，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d左右，待長滿菌絲后停止發(fā)酵。

1.2.2含量測定及方法學(xué)考察[3]。

1.2.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制。精密稱取蘆丁對照品20 mg，用60%乙醇溶解后，移入100 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻，即濃度為0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 ml試管中，補(bǔ)加30%乙醇至5 mL，再加5%的亞硝酸鈉溶液300 μL，搖勻后靜置6 min；然后加10%的六水氯化鋁600 μL，搖勻后靜置5 min，最后加入1.0 M的氫氧化鈉溶液，并用30%乙醇稀釋至刻度。然后在波長510 nm處測定吸光度，以蘆丁濃度(Y)對吸光度(X)進(jìn)行回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.3含量測定。精確稱取發(fā)酵土鱉蟲粉2.000 0 g，加入60 mL 80%濃度的乙醇溶液，先超聲波震蕩處理20 min，于100 ℃的溫度下回流2.5 h。將黃酮粗提液抽濾，棄去殘?jiān)?，收集濾液。然后將濾液于4 ℃下8 000 r/min離心20 min，收集上清液入50 mL容量瓶，用30%濃度的乙醇定容至刻度。精確吸取2 mL，按照前文所述方法，自“加30%乙醇至5 mL”起，依次測定吸光度，通過回歸方程求得待測樣品溶液中黃酮的濃度(C)。

1.2.2.4樣品的精密度考察。準(zhǔn)確稱取發(fā)酵土鱉蟲粉樣品2.000 0 g，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取和制備溶液，精確吸取同一批試樣液平行測定 5次，每次2 ml，分別用紫外分光光度法測定510 nm下其黃酮類化合物的吸光度(A510)并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD。

1.2.3.5重現(xiàn)性考察。準(zhǔn)確稱取發(fā)酵土鱉蟲粉樣品5份，每份2.000 0 g，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取和制備溶液，重復(fù)測定5次。

1.2.2.6黃酮化合物的回收率測定。準(zhǔn)確稱取已測知總黃酮含量的發(fā)酵土鱉蟲粉樣品5份，每份2.000 0 g，各加入5.00 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取和制備溶液，并進(jìn)行測定。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制由圖1可知，建立的回歸方程為：Y=1.123 1x，r=0.999 0。結(jié)果表明，蘆丁(黃酮類化合物)濃度在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)，其濃度與對應(yīng)的吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，符合Lambert-Beer定律，根據(jù)吸光度來計(jì)算其含量是可靠的。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Fig.1　Equation of rutin standard curve

2.2樣品的精密度連續(xù)5次測定吸光值，樣品中黃酮含量分別為4.578 1、4.562 5、4.532 1、4.489 1、4.721 3、4.545 3，RSD=1.92%(n=5)。結(jié)果表明，樣品精密度良好。

2.3方法的重現(xiàn)性對方法的重現(xiàn)性考察結(jié)果(表1)，表明，該方法重現(xiàn)良好，RSD<1.50%。

表1　重現(xiàn)性試驗(yàn)

2.4黃酮化合物的回收率表2表明，土鱉蟲樣品中黃酮化合物的回收率為95.00%±10.00%，其平均值為99.82%，RSD=2.09%(n=5)。

表2　回收率試驗(yàn)

2.5樣品總黃酮含量試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品重復(fù)3次測定的總黃酮含量平均值為4.6308，RSD為2.37%。

3　討論

該試驗(yàn)采用NaNO2-AlCl3-NaOH顯色劑與發(fā)酵土鱉蟲中的總黃酮發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成吸光物質(zhì)，然后通過紫外分光光度法測定了發(fā)酵土鱉蟲中總黃酮類化合物含量，并進(jìn)行方法學(xué)考證。結(jié)果表明，該方法可靠、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，并且操作簡便、快速，可用于發(fā)酵土鱉蟲黃酮類化合物含量的測定，同時(shí)也為從發(fā)酵土鱉蟲粉中提取黃酮類化合物并加以利用提供了理論依據(jù)。但是發(fā)酵土鱉蟲存在的黃酮類化合物往往是混合物而非單一組分，用紫外分光光度法測定的黃酮類化合物含量，有可能是黃酮及其異構(gòu)體的總量，如多聚酮、異黃酮等。因此將來有必要探索分離度高的測定方法，如高效液相色譜法、薄層掃描法等。

目前關(guān)于蟲類中藥的發(fā)酵炮制制藥研究報(bào)道并不多見。白僵菌在土鱉蟲這個(gè)天然固體培養(yǎng)基上的生長、代謝會發(fā)生一系列復(fù)雜的分解合成反應(yīng)，產(chǎn)生新的成分和新的功能，使發(fā)酵的作用從原來僅具營養(yǎng)作用的培養(yǎng)基變?yōu)檎婢鷮ε囵B(yǎng)基的分解、轉(zhuǎn)化、修飾、互相影響的雙向型固體發(fā)酵模式，從而產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、多糖、白僵菌素、黃酮等，而且這些生物大分子化合物均具有一定的抗腫瘤、抗病毒等多種藥效。尤其在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生許多黃酮類化合物，這些物質(zhì)能夠通過清除氧自由基抗衰老、抑制癌細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡、降低心血管疾病以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理活性[4]。因此發(fā)酵后的土鱉蟲在抗腫瘤、抗病毒、降低心血管系統(tǒng)疾病的藥理活性方面應(yīng)該會有某些變化，有待于進(jìn)一步研究。

[1] 楊耀芳，楊翊雯，王賽前，等.土鱉蟲口服液鎮(zhèn)痛、活血化瘀與紅細(xì)胞免疫研究[J].中成藥，2003，25(6)：496-498.

[2] 金向群，嚴(yán)銘銘，黃恩喜，等.土鱉蟲脂溶性成分的研究[J].中國中藥雜志，1993，18(6)：355-356.

[3] 蔣學(xué).白僵蠶活性成分分離純化及其藥理作用的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2013

[4] 張楫.天然黃酮類化合物的合成研究[D].昆明：昆明理工大學(xué)，2014.

[5] HU C Q，CHEN K，SHI Q，et al.Anti-AIDS agents.10.acacetin-7-O-beta-D-galactopyranoside，an anti-HIV principle from chrysanthemum-morifolium and a structure-activity correlation with some related flavonoids[J].Journal of natural products，1994，57(1)：42-51.

Determination and Methodological Investigation on the Total Flavonoids Content in FermentedEupolyphagasinesisWalker

WANG Li-na1, MA Ming-zhu1,WANG Ji-hui2*

(1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji’nan, Shandong 250355; 2. The Experiment Center, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji’nan, Shandong 250355)

[Objective] To detect the total flavonoids content in ethanol extracts from fermentedEupolyphagasinesisWalker, and to investigate the methodology. [Method] NaNO2-AlCl3-NaOH colorimetry was used to detect the complex absorbance formed by flavonoids compounds and color developing agent. [Result] The detected standard curve had good linear correlation,r= 0.999 0. The linear range was between 0.02 and 0.10 mg/mL. The precision of the test wasRSD=1.92%; repeatability wasRSD= 1.23%; sample recovery rate was 95.00%±10.00%,RSD=2.09%. The average content of total flavonoids was 4.630 8 mg/g. [Conclusion] Results of methodological investigation showed that the standard curve, linear range, precision, accuracy and repeatability of total flavonoids content in fermentedE.sinesisall meet the requirements of relevant provisions, which are detected by ultraviolet spectrophotometry. This method is accurate, reliable and can be used for content detection of total flavonoids.

FermentedEupolyphagasinesisWalker; Flavonoids complex compound; Methodological investigation

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015325)。

王立娜(1996-)，女，山東臨沂人，本科，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，副教授，從事蟲類中藥發(fā)酵及活性成分研究。

2016-05-30

R 282.74

A

0517-6611(2016)21-095-03