周　桂,謝貽冬,趙　欽,吳丹丹,陳歡兒,江　蕾,武　波

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室,廣西南寧 530006;2.廣西民族師范學(xué)院,廣西崇左 532200)

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白骨壤抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌的抑制作用

周桂1,謝貽冬1,趙欽1,吳丹丹1,陳歡兒1,江蕾1,武波2,*

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室,廣西南寧 530006;2.廣西民族師范學(xué)院,廣西崇左 532200)

本文以紅樹植物白骨壤葉為材料,以硫酸銨分級沉淀分離不同的抗菌蛋白,采用抑制菌絲生長速率和孢子萌發(fā)的方法測定白骨壤抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌的抗菌活性,顯微觀察分析抗菌作用方式機理,進行白骨壤抗菌蛋白對感病香蕉的貯藏防病實驗。結(jié)果表明:35%、75%、85%硫酸銨沉淀分離的抗菌蛋白(抗菌蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)具有明顯抗菌活性,其抑制菌絲生長的半效應(yīng)濃度(EC50)分別為:7.93±0.29、6.80±0.28、16.21±0.13 μg/mL。100 μg/mL的抗菌蛋白(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)溶液對香蕉炭疽分生孢子的萌發(fā)抑制率分別達到95.5%±0.01%、97.5%±0.03%、92.5%±0.01%。顯微觀察發(fā)現(xiàn)三種抗菌蛋白處理的菌絲分別出現(xiàn)了扭曲、斷裂、畸形以及原生質(zhì)外滲現(xiàn)象。經(jīng)抗菌蛋白處理后的采后感病香蕉果實具有明顯降低發(fā)病率的效果。抗菌蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對香蕉炭疽病的防治效果分別達到74.48%±0.68%、77.24%±0.53%、75.87%±0.24%。

白骨壤,抗菌蛋白,香蕉炭疽病,抗菌活性,抗菌機理

香蕉是熱帶和亞熱帶地區(qū)普遍種植食用的水果,其味香,并富含鉀元素,有“南國四大果品之一”之稱[1-2]。香蕉炭疽病(Calletotrichum musae)是危害香蕉生產(chǎn)最嚴重的病菌之一[3],能使香蕉葉變黃,果實變黑、腐爛。因炭疽病菌的浸染具有潛伏性,使得采后香蕉在運輸期間的發(fā)病最為嚴重,造成的病害是世界性的[4-5]。采取化學(xué)手段對香蕉炭疽病進行控制容易造成農(nóng)藥殘留超標和環(huán)境污染,且長期大量使用化學(xué)藥物易使病菌產(chǎn)生耐藥性。所以,從自然界中尋找高效、無毒、環(huán)保的植物天然抑菌成分,用于果蔬的炭疽病害防治,越來越受到人們的重視[6-11]。

植物抗菌蛋白(Antimicrobial protein)是植物生理反應(yīng)中一種重要的免疫分子,存在于植物各器官和組織中[12]。這些蛋白在一級序列的基礎(chǔ)上可被分為轉(zhuǎn)脂蛋白、硫堇、植物防御素、Hevein和Knottin型蛋白家族[13]。他們能夠有效地抑制許多病原細菌和真菌的生長,已有用于腫瘤治療和病菌感染治療及農(nóng)作物真菌病害防治的研究報道[14-19]。

白骨壤(Avicenniamarina)是馬鞭草科紅樹植物,生長于高鹽度的海岸潮間帶[20],具有紅樹先鋒樹種稱號。作為廣西北部灣的民間傳統(tǒng)藥食同源植物,白骨壤具有抗癌、收斂止血、斂肺止咳、澀腸止瀉等功效[21],常用于醫(yī)治膿腫、出血、腹瀉、蛇蟲咬傷、潰瘍、瘧疾等疾病。但有關(guān)白骨壤抗菌蛋白的研究沒見報道。本文以白骨壤葉為材料,篩選研究不同的蛋白成分對香蕉炭疽病菌的抗菌活性,為海岸潮間帶植物用于果蔬病害的綠色防治提供理論與實踐基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白骨壤葉采自廣西北海紅樹林生態(tài)自然保護區(qū),并于本實驗室-20 ℃冰箱凍存。供試香蕉炭疽病菌(Calletotrichum musae)由廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室分離和保存。

供試培養(yǎng)基:固體PDA培養(yǎng)基(土豆200.00 g,葡萄糖20.00 g,瓊脂20.00 g,水1000 mL,pH7),液體PDA培養(yǎng)基:(土豆200.00 g,葡萄糖20.00 g,水1000 mL,pH7)。

供試香蕉品種為成熟度和物理狀況基本一致的西貢蕉。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;HeraeusTMMultifugeTMX1冷凍高速離心機美國Thermo公司;BX43熒光倒置顯微鏡日本Olympus公司;HZ250LBG恒溫搖床金壇瑞華儀器有限公司;HPS-250生化培養(yǎng)箱哈爾濱東明醫(yī)療儀器有限公司;BYC-310低溫冷藏柜山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;超低溫冰箱美國NUAIRE-6382E;HV-110高壓滅菌鍋日本Hirayama;Smart Spec TM plus核酸蛋白測定儀美國伯樂Bio-Rad;SW-CJ-2F超凈工作臺上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

1.2白骨壤抗菌蛋白的制備與濃度測定

取白骨壤鮮葉100 g于4 ℃低溫研勻漿,加入10倍體積的Tris-HCl提取緩沖液(pH9)4 ℃提取48 h,分別用35%、45%、55%、65%、75%、85%的硫酸銨進行沉淀,4 ℃ 12000 r/min離心30 min收集沉淀,并溶解于0.01 mol/L pH7的PBS緩沖液中,用3 ku管超濾除鹽,即為抗菌蛋白提取液。采用Bradford法測抗菌蛋白在595 nm處的OD值,利用標準曲線換算得到濃度。將制備的蛋白液用0.22 μm的除菌過濾器在無菌環(huán)境中過濾,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3供試病菌的活化

配制PDA固體培養(yǎng)基,于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min,備用。在超凈工作臺中將供試菌種試管斜面接種PDA培養(yǎng)基中,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d備用。

1.4白骨壤抗菌蛋白抗香蕉炭疽病菌的活性檢測

1.4.1抗菌蛋白活性篩選用濾紙片擴散法[22]進行抗菌蛋白的活性篩選,無菌條件下用無菌0.01 mol/L pH7的PBS分別將不同飽和度硫酸銨沉淀制備的蛋白稀釋成40 μg/mL的濃度,再取20 μL涂布于直徑9 mm的滅菌濾紙片上,冷凍干燥后備用。

在無菌環(huán)境下,用打孔器在靶菌落邊沿取直徑7 mm的菌餅,接種到固體PDA培養(yǎng)基中,在離菌餅15 mm處貼上涂抹了蛋白液的濾紙片,每個處理設(shè)3個重復(fù),放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d,觀察抑菌圈出現(xiàn)的情況。

1.4.2抗菌蛋白抑制菌絲生長的毒力檢測選擇有抗菌活性的抗菌蛋白,在無菌條件下加入到PDA培養(yǎng)基中,分別配制成40、30、20、10、5 μg/mL的含蛋白培養(yǎng)基。將7 mm直徑的菌餅接種到含抗菌蛋白的培養(yǎng)基中央,以PBS作為對照,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d,每個處理設(shè)3個重復(fù)。十字交叉法[23]測菌落的直徑,計算各濃度蛋白的抑菌率。并以蛋白濃度的對數(shù)值為自變量X,以抑菌率的機率值Y為因變量,應(yīng)用SPSS軟件計算出蛋白抑制菌絲生長的毒力回歸方程及其半效應(yīng)濃度EC50。

抑菌率(%)=對照菌落凈生長直徑-處理菌落凈生長直徑/對照菌落凈生長直徑×100

1.4.3抗菌蛋白對病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性檢測在無菌條件下,用100 μg/mL抗菌蛋白液配制香蕉炭疽病菌的孢子懸液(濃度為106個/mL),用載玻片懸滴法[24]在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,以PBS為對照,用血球計數(shù)法觀察分生孢子萌發(fā)情況,計算萌發(fā)抑制率。

萌發(fā)抑制率(%)=對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率/對照孢子萌發(fā)率×100

1.4.4抗菌蛋白對液體培養(yǎng)菌絲生長的抑制作用配制PDA液體培養(yǎng)基,經(jīng)121 ℃滅菌30 min后,在無菌條件下加入抗菌蛋白液,配制成濃度為10 μg/mL的含抗菌蛋白培養(yǎng)基,并接種香蕉炭疽病菌的孢子懸液5 μL(濃度為106個/mL),以PBS為對照,于28 ℃恒溫搖床培養(yǎng)4 d,觀察培養(yǎng)液中菌絲球的生長情況,并通過鏡檢對其抑菌機理進行初步判斷。

1.5抗菌蛋白防治感病香蕉炭疽病菌的效果測定

將入選的香蕉果實表面消毒、洗凈、晾干,涂抹上100 μg/mL的抗菌蛋白液,自然晾干后接種香蕉炭疽病菌孢子懸液100 μL(濃度為106個/mL),以PBS為對照,28 ℃,95%的濕度條件下觀察并統(tǒng)計香蕉發(fā)病率和防治效果。每30根香蕉果實為一個處理,每個處理重復(fù)3次,儲藏一周后統(tǒng)計各處理的發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

表2　三種抗菌蛋白對菌絲生長的抑制作用

注:表中字母不同表示在5%水平上的差異顯著，表3、表4同。

香蕉炭疽病情指數(shù)的分級標準:0級:無病害;1級:果面有少許病斑,病斑面積占果面積約1/16;2級:較多病斑,病斑面積占果面積的1/8;3級:病斑面積占果面積約1/4,或病斑在基部1/2內(nèi)的主脈上;4級:病斑面積占果面積約1/2,或病斑在基部;5級:病斑面積占果面積約3/4,果體松軟腐爛,果柄易折斷。

病情指數(shù)=∑(各級病果數(shù)×相對級數(shù))/處理總果數(shù)×5×100

防治效果(%)=對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)/對照病情指數(shù)×100

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有相關(guān)數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次,取平均值,運用origin9.0和SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,并采用鄧肯氏新復(fù)極差進行差異顯著性檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1抗菌蛋白的篩選

以不同飽和度的硫酸銨沉淀分離,并經(jīng)過超濾透析的蛋白,用濾紙片擴散法檢測,分別表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性(表1),其中35%、75%、85%(NH4)2SO4沉淀析出的蛋白具有顯著的抑菌活性,而45%、55%、65%(NH4)2SO4沉淀析出的蛋白沒有表現(xiàn)出顯著(p<0.05)的抑菌活性,表明不同飽和度的(NH4)2SO4沉淀析出的蛋白的抑菌活性存在顯著的差異。故選擇35%、75%、85%(NH4)2SO4沉淀析出制備的蛋白作為進行抑菌活性進一步研究對象。

表1　抗菌蛋白活性篩選

注:++,+和-分別表示抑菌圈極顯著、顯著、不顯著。

2.2三種抗菌蛋白對固體培養(yǎng)菌絲生長的抑制作用

35%、75%、85%硫酸銨沉淀析出制備的三種抗菌蛋白(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)對香蕉炭疽病菌的菌絲生長均具有顯著的抑制作用(表2)。隨著培養(yǎng)基中抗菌蛋白濃度的增加,炭疽病菌的菌落直徑逐漸減小,抑菌率逐漸增加,三種抗菌蛋白的抑菌活性均表現(xiàn)出濃度效應(yīng)。

抗菌蛋白Ⅰ與Ⅱ的EC50無明顯差別(p>0.05),而抗菌蛋白Ⅲ的EC50則明顯(p<0.05)高于抗菌蛋白Ⅰ與Ⅱ。表明抗菌蛋白Ⅰ與Ⅱ抑制菌絲生長的毒力相對抗菌蛋白Ⅲ強。

2.3抗菌蛋白對孢子萌發(fā)的抑制作用

100 μg/mL白骨壤抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌孢子萌發(fā)具有顯著(p<0.05)的抑制作用,其中抗菌蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對分生孢子的萌發(fā)抑制率分別達到95.5%±0.01%、97.5%±0.03%,92.5%±0.01%。

由此可見三種白骨壤抗菌蛋白不僅對香蕉炭疽病菌的菌絲有顯著的抑制作用,并且對孢子的萌發(fā)也有顯著的抑制作用。

2.4抗菌蛋白對液體培養(yǎng)的香蕉炭疽病菌的抑制作用

由圖1可以看出,與對照相比(圖1a),在PDA液體培養(yǎng)基中分別添加三種抗菌蛋白(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)搖床培養(yǎng)4 d后沒有產(chǎn)生菌絲球,且液體變渾濁,在液面上方瓶壁出現(xiàn)掛壁菌膜。而在PBS對照組中產(chǎn)生較多的菌絲球,且培養(yǎng)基仍為澄清的黃色透明液體,瓶壁上無掛壁菌膜出現(xiàn)。

表3　三種抗菌蛋白對孢子萌發(fā)的抑制作用

圖1　抗菌蛋白對液體培養(yǎng)的香蕉炭疽病菌抑制作用Fig.1　Inhibition of antimicrobial proteins against banana anthrax in liquid culture注:a:對照,b、c、d分別為抗菌蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理，圖2～圖4同。

對培養(yǎng)液的鏡檢結(jié)果進一步確定了抗菌蛋白處理引起了菌絲斷裂和變形現(xiàn)象(圖2)。PBS對照組中取出菌絲球后的培養(yǎng)液在顯微鏡下觀察到少量的分散態(tài)正常菌絲?？咕鞍注裉幚淼呐囵B(yǎng)液在鏡下觀察到一些不規(guī)則的細胞碎片,抗菌蛋白Ⅱ處理的培養(yǎng)液在鏡下觀察到不但出現(xiàn)細胞碎片,而且有大量細小且斷裂的畸形菌絲,抗菌蛋白Ⅲ處理的培養(yǎng)液在鏡下也出現(xiàn)許多細胞碎片,由此可進一步確定香蕉炭疽病菌在抗菌蛋白的作用下發(fā)生了菌絲斷裂和變形現(xiàn)象。

圖2　抗菌蛋白處理菌液鏡檢圖Fig.2　The microscopic examination graphof the fungal liquid by antimicrobialprotein treatment

通過對掛壁菌膜的鏡檢,發(fā)現(xiàn)3種抗菌蛋白抗香蕉炭疽病菌的作用方式有所不同(圖3)。抗菌蛋白Ⅰ處理的菌膜中菌絲呈現(xiàn)出扭曲變形,并產(chǎn)生少量棕黃色代謝產(chǎn)物?？咕鞍注蛱幚淼木ぶ械木z出現(xiàn)嚴重的扭曲斷裂、腫脹狀態(tài),且產(chǎn)生棕黃色的代謝物使顏色變黃,抗菌蛋白Ⅲ處理的菌膜中菌絲呈干癟扭曲形態(tài)。

圖3　抗菌蛋白處理后菌絲形態(tài)變化Fig.3　Morphological changes of myceliumafter treatment with antimicrobial proteins

由此可見,三種不同的抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌的形態(tài)改變有著不同的作用方式,有待更進一步深入研究和探討。

2.5抗菌蛋白防治香蕉炭疽病菌的效果

采后感病香蕉經(jīng)三種抗菌蛋白液分別處理后,在28 ℃下儲藏一周后依然處于輕微病害發(fā)生狀態(tài),而PBS對照組香蕉變黑并開始腐爛(圖4),三種抗菌蛋白液處理后的香蕉病情指數(shù)與PBS對照組形成顯著(p<0.05)的差異,抗菌蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對采后香蕉的炭疽病防治效果分別達到74.48%±0.68%、77.24%±0.53%、75.87%±0.24%,對香蕉炭疽病的防治效果良好。

圖4　抗菌蛋白對香蕉炭疽病的防治效果Fig.4　Effect of antimicrobial proteins on the prevention and cure of banana

表4　抗菌蛋白對香蕉炭疽病的防治效果

3　結(jié)論與討論

抗菌蛋白作為一種可替代抗生素的生物體天然產(chǎn)物,對植物真菌生長有很強的抑制作用。Grewal等從銅綠假單胞菌中分離到一種新型蛋白可以抑制5種植物真菌生長[25]。Pelegrini等人從百香果種子分離出的小分子蛋白類似于2S清蛋白家族,能夠抑制煙曲霉等6種真菌的生長[26]。這些抗菌蛋白具有的廣譜抗菌性、低濃度高效應(yīng)及對微生物作用方式的廣泛性等特征使得它們的開發(fā)和利用具有廣闊的前景[27]。

三種抗菌蛋白的作用方式有所不同,鏡檢結(jié)果顯示出炭疽病菌菌絲畸變甚至斷裂的現(xiàn)象,這可能是抗菌蛋白直接破壞細胞壁幾丁質(zhì)的形成或者激活菌體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶而裂解幾丁質(zhì),或者細胞膜離子失衡引起菌體斷裂所導(dǎo)致[28]。因此,可以對其抑菌機理和理化性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)進行進一步的研究探討,為海洋植物天然抗菌蛋白的開發(fā)和應(yīng)用奠定理論和實踐基礎(chǔ)。

本文以紅樹林白骨壤為材料,從葉子中提取天然抗菌蛋白,對其抗香蕉炭疽病菌的活性及作用方式進行探討。35%、75%、85%硫酸銨沉淀分離的三種抗菌蛋白(抗菌蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)對香蕉炭疽病菌的菌絲生長和孢子的萌發(fā)都有極強的抑制作用,其抑制菌絲生長的EC50分別為7.93±0.29、6.80±0.28、16.21±0.13 μg/mL。100 μg/mL的抗菌蛋白(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)溶液對香蕉炭疽分生孢子的萌發(fā)抑制率分別達到95.5%±0.01%、97.5%±0.03%、92.5%±0.01%。經(jīng)抗菌蛋白處理后的采后感病香蕉發(fā)病率顯著降低?？咕鞍注?、Ⅱ、Ⅲ對香蕉炭疽病的防治效果分別達到74.48%±0.68%、77.24%±0.53%、75.87%±0.24%,對香蕉炭疽病均具有良好的防治效果,為采后香蕉的保鮮和貯藏提供良好的理論和實踐意義。

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Inhibition ofAvicenniaMarinaantimicrobial protein against banana anthrax

ZHOU Gui1,XIE Yi-dong1,ZHAO Qin1,WU Dan-dan1,CHEN Huan-er1,JIANG Lei1,WU Bo2,*

(1.School of Marine Sciences and Biotechnology,Guangxi University for Nationalities/Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources,Nanning 530006,China;2.Guangxi Noraml University for Nationalities,Chongzuo 532200,China)

In this paper,the leaves ofAvicenniaMarinawere selected as materials. The different antimicrobial proteins were isolated by ammonium sulphate precipitation on different saturation ranges. The inhibition ratio of antimicrobial proteins against banana anthrax was evaluated by mycelial growth rate and spore germination. Storage experiments of postharvest banana fruits treated by the antimicrobial proteins were carried out separately. The results showed that,the three type of antimicrobial proteins separated by 35%,75%,85% ammonium sulfate precipitation(antimicrobial proteinⅠ,Ⅱ,Ⅲ)showed obvious antifungal activity,which inhibited mycelial growth and the EC50value was 7.93±0.29,16.21±0.28,6.80±0.13 μg/mL,respectively. The inhibition ratio of 100 μg/mL antimicrobial protein(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)against spore germination was 95.5%±0.01%,97.5%±0.01%and 92.5%±0.01% respectively. By microexamination it was found that the three type of antimicrobial proteins could induce deformed growth of hyphae of banana anthrax,including twist of hyphae,necrosis of the hyphal wall and leakage of the cytoplasma. Application of the antimicrobial protein lead to a significant decrease in the incidence of banana anthrax during storage of postharvest banana fruits. The control efficiency of antimicrobial protein(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)on banana anthracnose was 74.48%±0.68%,77.24%±0.53% and 75.87%±0.24%,respectively.

Avicenniamarina;antimicrobialprotein;banana anthracnose;antimicrobial activity;antimicrobial mechanism

2015-12-02

周桂(1969-)，女, 博士，教授，研究方向：生物化學(xué)，E-mail：13077739608@163.com。

武波(1962-)，男, 博士，教授，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：wubo@gxnun.edu.cn。

廣西自然科學(xué)基金項目(2014GXNSFAA118047)；廣西自然科學(xué)基金項目(2014GXNSFAA118076);廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目(2D2014041)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項目(桂科合14125008-1-2); 2015年廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助研究生科研創(chuàng)新項目(YCSZ2015129);2015年廣西大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510608085)。

TS205.9

A

1002-0306(2016)13-0072-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.006