錢紅玫,胡文忠,馮　可,薩仁高娃,邵文俊

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

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食源性致病菌快速檢測的前增菌培養(yǎng)的研究進(jìn)展

錢紅玫1,胡文忠2,*,馮可3,薩仁高娃3,邵文俊2

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

近年來,由食源性致病菌污染食物導(dǎo)致中毒或死亡事件在全球頻發(fā),嚴(yán)重危害人類健康,食源性微生物引起的疾病已成為危害人類健康的頭號殺手。目前,食源性致病菌快速檢測技術(shù)研究已成為國際學(xué)者關(guān)注的熱點,研究的焦點主要集中在快速檢測技術(shù)。但是,在快速檢測中,尤其是分子生物學(xué)檢測技術(shù)需要增菌過程,如何縮短前增菌時間和提高增菌效果,是快速檢測研發(fā)解決的難題。本文對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌的爆發(fā)案例進(jìn)行了簡述,重點綜述了前四種菌的前增菌的研究現(xiàn)狀,以便了解到現(xiàn)有的快速檢測的前增菌培養(yǎng)的研究情況,在更短時間檢測出食源性致病菌。

食源性致病菌,增菌培養(yǎng),快速檢測

食源性致病,是食品安全性問題重要的關(guān)注點,也是食品安全研究的一個重要方向。據(jù)統(tǒng)計,世界因食品污染而致病的人數(shù)已達(dá)數(shù)億人,其中由生物性污染造成的人數(shù)占首位[1],是一個十分嚴(yán)重的安全問題。近幾年來,隨著科技的發(fā)展,工業(yè)食品也隨之增加,伴隨著對工業(yè)食品的大量食用,食源性致病菌污染食品而引起的中毒爆發(fā)事件在全球時有發(fā)生,據(jù)統(tǒng)計,40%的中毒爆發(fā)事件是因為餐館或生產(chǎn)機(jī)構(gòu)生產(chǎn)時食物被污染[2]。食源性感染往往會大量的感染人群,會在學(xué)校,工廠、餐廳等許多機(jī)構(gòu)迅速的發(fā)生,病原體的快速檢測和鑒定是控制食源性疾病爆發(fā)的關(guān)鍵問題[3]。面對如此大的致病率,食源性致病菌的快速檢測問題也得到了普遍的關(guān)注。在致病微生物中,沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌等幾種菌是常見的因污染果蔬、肉類、海產(chǎn)品而引發(fā)致病的菌種。目前,利用傳統(tǒng)的檢測方法檢測食源性致病菌仍存在著檢測時間長、操作方法復(fù)雜、檢驗結(jié)果不準(zhǔn)確等問題,因此,如何能快速增菌,是實現(xiàn)快速檢測的前提。雖然現(xiàn)有的分子生物學(xué)檢測技術(shù)已經(jīng)相對成熟,但將前增菌與檢測技術(shù)相結(jié)合的研究仍然是一個盲點,有待進(jìn)一步的改進(jìn)。本文對近幾年食源性致病菌的爆發(fā)情況和現(xiàn)有的前增菌培養(yǎng)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,以期對未來的快速檢測研究有一定的參考價值。

1　常見的食源性致病菌的爆發(fā)

食源性致病菌一直是食品安全問題的一個隱患,在全球,每年都會有大量的人群被食源性致病菌威脅到生命安全,表1對近幾年來幾種常見的食源性致病菌的爆發(fā)案例進(jìn)行了列舉。

表1　幾種常見的食源性致病菌的爆發(fā)案例

從上表1可以看出,近3年來,在世界各地,因餐廳或工廠的衛(wèi)生問題而導(dǎo)致食物被食源性致病菌感染,進(jìn)而引發(fā)的食源性疾病的爆發(fā)情況仍然存在,其爆發(fā)情況一般是小面積大量爆發(fā),因沒有及時的應(yīng)對措施,常常會引起人群的恐慌,并讓大家對食品安全性問題產(chǎn)生質(zhì)疑。面對如此嚴(yán)峻的形勢,食源性致病菌快速檢測的問題也隨之變得尤為重要。

2　食源性致病菌單菌的增菌培養(yǎng)的研究

2.1沙門氏菌前增菌培養(yǎng)的研究

雖然分子生物學(xué)方法[14]和免疫學(xué)方法[15]能快速檢測沙門氏菌污染樣品的狀況,但通過前增菌培養(yǎng)使菌體達(dá)到檢測量也十分的重要。根據(jù)沙門氏菌的國家檢測標(biāo)準(zhǔn)[16],沙門氏菌的檢出時間大約在3～4 d,時間十分漫長。索標(biāo)[17]等人結(jié)合熒光PCR檢測技術(shù),對熱損傷沙門氏菌檢測前的選擇性增菌進(jìn)行了研究,其對已有的SEL培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,向其中添加了0.01 g/L的吖啶黃、0.05 g/L的環(huán)己酰亞胺、0.05 g/L的磷霉素以及0.002 g/L的萘啶酸,最終得到的培養(yǎng)基作為損傷沙門氏菌的修復(fù)劑以達(dá)到增菌的效果。實驗結(jié)果表明,SEL可以在20 h內(nèi)可以使各種接種量的菌體修復(fù)至109CUF/mL。郭闖[18]等人也結(jié)合了PCR技術(shù)對快速檢測的前增菌進(jìn)行了研究,其選用了氯化鎂孔雀綠增菌液(MM)和緩沖蛋白胨水(BPW)兩種增菌液進(jìn)行了研究,并將兩種增菌液的增菌效果進(jìn)行了比較,研究結(jié)果表明,短時間內(nèi),BPW的增菌效果明顯優(yōu)于MM,增菌24 h后兩種增菌液的增菌效果基本相同;對BPW不同增菌時間的增菌效果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)8 h的增菌效果是最佳效果。范媛媛[19]等人對一種新推出的SX2液體培養(yǎng)基進(jìn)行了驗證,SX2液體培養(yǎng)是應(yīng)用于前增菌的一種新型培養(yǎng)基,這種培養(yǎng)基可以省去劃平板和觀察菌落特征的時間,且得出結(jié)果準(zhǔn)確,是實驗室快速檢測沙門氏菌的一種選擇。

2.2金黃色葡萄球菌前增菌培養(yǎng)的研究

金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界中,到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20種以上的金黃色葡萄球菌和類似金黃色葡萄球菌[20]。我國每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位[21]。由于金黃色葡萄球菌對人體健康有重大影響,各國均將該菌作為食品重點檢測和監(jiān)控的項目。目前我國的檢測方法主要是按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10-2010[21]進(jìn)行的,其檢出時間一般在36～72 h。為了找出一種更快捷的增菌方法用以檢驗,李曉琍[22]等人對2種增菌液的增菌效果進(jìn)行了研究。其利用菌體在Baird-Parker瓊脂平板上的生長情況來比較驗證2種增菌培養(yǎng)基的增菌效果。實驗結(jié)果表明,在金黃色葡萄球菌含量比較高時,采用7.5%氯化鈉肉湯增菌,只需要6 h就可以使菌體濃度從100CUF/mL增加至105CUF/mL;而對于金黃色葡萄球菌含量比較低而雜菌含量高的情況,則采用10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的增菌效果更好,但在培養(yǎng)24 h后才能達(dá)到增菌的效果。為了更快的檢測出金黃色葡萄球菌,李瑩[22]以營養(yǎng)瓊脂為基礎(chǔ),通過添加促進(jìn)金黃色葡萄球菌生長的添加劑,最終得到配方:蛋白胨10 g/L、酵母粉5.0 g/L、丙酮酸鈉5.0 g/L、氯化鈉20 g/L、亞碲酸鉀20 mg/L、氯化鋰5 g/L、瓊脂15 g/L、5-溴·4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.3 g/L。經(jīng)過實驗驗證,與傳統(tǒng)的Baird-Parker瓊脂平板相比,其在18 h就可以檢出菌體,與傳統(tǒng)方法相比,大大縮短了時間,檢出率達(dá)到(90.2±6.7)%,檢測結(jié)果與國標(biāo)無明顯差異,證明了其有效性。張超楠[23]將計算機(jī)視覺技術(shù)與前增菌技術(shù)結(jié)合,通過對促進(jìn)劑和抑制劑的選擇,得到配方:胰蛋白胨17.0 g/L,植物蛋白胨3.0 g/L,氯化鈉68 g/L,磷酸氫二鉀2.5 g/L,葡萄糖2.5 g/L,丙酮酸鈉5 g/L,甘氨酸9 g/L,亞碲酸鉀60 mg/L,苯乙醇3.8 mL/L。此增菌培養(yǎng)基在4 h內(nèi)可以抑制除金黃色葡萄球菌外的生長,并可以達(dá)到增菌的效果,其在10～107CFU/mL(g)的菌落數(shù)范圍內(nèi)都可以檢出,與傳統(tǒng)方法相比,不僅節(jié)省了時間,并且可以準(zhǔn)確的檢出。

2.3單增李斯特菌前增菌培養(yǎng)的研究

該病原菌廣泛分布于自然界,有較強(qiáng)的生存能力,但一般情況下,食品中單增李斯特菌含量較低,且往往在加工中受到損傷[26-28]。因此,分離單增李斯特菌之前,必須對待檢樣品進(jìn)行增菌。目前我國的檢測方法主要是按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.30-2010[29]進(jìn)行的,其檢出時間一般在4～6 d。近幾年來,很多研究人員對單增李斯特菌的增菌進(jìn)行了研究,其中朱敏[30]等人就做了有關(guān)于改良李斯特菌增菌液的研究。因李斯特菌的顯色培養(yǎng)基增菌效果沒有那么明顯,故向其中加入增菌劑和抑菌劑,將不同濃度的吖啶黃、萘啶酮酸、亞碲酸鉀、氯霉素加入增菌液中,發(fā)現(xiàn)用吖啶黃15 mg/L、萘啶酮酸20 mg/L、亞碲酸鉀15 mg/L的李斯特菌改良增菌液增菌,單增李斯特菌檢出率明顯高于國標(biāo)法(p<0.05),單增李斯特菌的檢出率明顯提高了很多。傅宜方[31]等人提出了一種“前增菌方法”,即對損傷的李斯特菌進(jìn)行修復(fù)以使菌體數(shù)量達(dá)到更多,使檢出效果更明顯,在用此方法增菌4 h后,與傳統(tǒng)方法比較,其檢出率為8.04%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)方法的檢出率1.79%,是前增菌的一個有利選擇。

2.4副溶血性弧菌前增菌培養(yǎng)的研究

副溶血性弧菌(VP)每年導(dǎo)致大約35000人患有食源性疾病[32],因該菌是一種在海洋中或鹽湖中廣泛生長的嗜鹽菌,所以其一般浸染的海產(chǎn)品居多[33]。目前我國的檢測方法主要是按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.7-2010[34]進(jìn)行的,其檢出時間一般在44～66 h。為了提高副溶血性弧菌的檢出率,檢測前的前增菌是必不可少的,現(xiàn)有的培養(yǎng)基增菌時間過慢,因此,許多人對優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行了研究。趙廣英[35]等人根據(jù)副溶血性弧菌的培養(yǎng)生長條件以混合型蛋白胨和酵母浸膏為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,向其中添加有益于副溶血性弧菌增長的試劑,通過正交實驗得到配方:混合蛋白胨2%(胰蛋白胨1%、魚蛋白胨1%)、酵母浸膏0.2%、氯化鈉3.5%,當(dāng)用這種配方并調(diào)節(jié)pH至8.6時,其對副溶血性弧菌增菌效果是普通增菌液的(1.4±0.5)倍,由此可見,其增菌效果明顯提高,可以提前達(dá)到檢出限并可以提高檢出率。陳冠武[36]等人也對海水中的副溶血性弧菌的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,其通過將不同的副溶血性弧菌培養(yǎng)基組合或?qū)⑵渲幸环N弧菌培養(yǎng)基與堿性蛋白胨水相組合,并與常用于檢測弧菌的TCBS瓊脂和弧菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行比較,實驗結(jié)果表明,堿性蛋白胨水與3%氯化鈉堿性蛋白胨水組合后增菌5～6 h后,其對副溶血性弧菌的分離效果和檢出效果都有明顯的提高。劉雪飛[37]等人利用響應(yīng)面法優(yōu)化了副溶血性弧菌的培養(yǎng)基,最佳的配方:酪蛋白胨6.75 g/L、胰蛋白胨3.25 g/L、牛肉膏4.76 g/L、氯化鈉36.75 g/L。用此配方通過響應(yīng)面法進(jìn)行檢測,當(dāng)培養(yǎng)12 h后,其檢測結(jié)果是模型預(yù)測值的98.77%,可以充分的檢測出副溶血性弧菌,是一個可靠地結(jié)果。

3　食源性致病菌共增菌培養(yǎng)的研究

食源性疾病暴發(fā)時,引發(fā)暴發(fā)的致病菌并不明確,如果只對單一的菌種進(jìn)行增菌然后逐個檢測,十分的浪費人力與財力,因此,對于可以同時富集多種致病菌培養(yǎng)基的研究變得更加重要了。就目前而言,共增菌培養(yǎng)的研究相對較少,現(xiàn)最多只有三種菌的富集。常用的方法為向液體培養(yǎng)基中加入增菌劑和抑菌劑,通常向培養(yǎng)基中所添加的增菌劑與抑菌劑[38-39]有亞碲酸鉀、氯化鋰、甘露醇、丙酮酸鈉、吖啶黃、萘啶酮酸、檸檬酸鈉、水楊酸、苯乙醇、磷霉素等。

王永志[40]等人研制出了一種可以使沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌共增菌的培養(yǎng)基,其以15 g/L胰蛋白胨、5 g/L大豆蛋白胨、2.5 g/L磷酸二氫鉀、2.5 g/L葡萄糖、35 g/L氯化鈉為基礎(chǔ)增菌培養(yǎng)基,向其中加入增菌集和抑菌劑:氯化鋰0.5 g/L、牛膽鹽0.1 g/L、甘露醇2 g/L、亞碲酸鉀0.3 mg/L,最終得到的培養(yǎng)基可以充分滿足三種菌共同生長,增菌12 h就可以使菌從103CFU/mL增加至107CFU/mL,能夠充分達(dá)到檢測限。翁思聰[41]等人研制出了一種SSSV共增菌培養(yǎng)基,其可以使沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌同時生長,其以BPW為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,向其中加入促進(jìn)目標(biāo)菌生長,抑制其他菌的添加劑,最終得到配方:緩沖蛋白胨水20 g/L、魚蛋白胨12 g/L、膽鹽3號3 g/L、檸檬酸鈉1.5 g/L、氯化鋰1 g/L、亞碲酸鉀1.2 mg/L、氯化鈉15 g/L、葡萄糖2 g/L、甘露醇1 g/L、丙酮酸鈉4 g/L。將此配方調(diào)節(jié)pH至7.2±0.4進(jìn)行驗證,結(jié)果表明,利用SSSV培養(yǎng)三種菌8 h后,菌體濃度可達(dá)到106CFU/mL,不僅增菌時間短,增菌效果也十分明顯。陳萍[42]等人對沙門菌、志賀菌和金葡菌共增菌的培養(yǎng)基也進(jìn)行了研制,其利用PCR對增菌效果進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,增菌培養(yǎng)基在增菌4 h即可達(dá)到PCR的檢測限,接種100 CFU/mL的菌液,在培養(yǎng)12 h后,可增加至106～108CFU/mL的菌量,充分達(dá)到了增菌的效果。王虎虎[43]等人提出了一種新的增菌方法,3種菌共修復(fù),其利用TSB-YE作為修復(fù)亞致死狀態(tài)的致病菌,且得到了較好的增菌效果。

經(jīng)過這幾種培養(yǎng)基的比較,得出結(jié)果表明,大多數(shù)增菌培養(yǎng)基的研究都是以現(xiàn)有的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過添加對菌體有促進(jìn)作用的試劑,并抑制其他菌體的生長,得到一種全新的共增菌培養(yǎng)基,此培養(yǎng)基的研制可以同時富集多種致病菌,最終達(dá)到可以同時檢出的效果,節(jié)省檢出時間。

4　展望

目前,食品安全問題一直是各國關(guān)注的焦點,而食源性致病菌的致病問題又是這一焦點的核心,每年都會有眾多的人群受到食源性致病菌的毒害,因此,能夠方便、快速的檢測出食源性致病菌將是大勢所趨。就目前而言,食源性致病菌的快速檢測技術(shù)要從快速增菌和快速檢測兩個方向入手,如何能夠在短時間內(nèi)大量增菌,如何能夠快速、簡捷的分離提取出致病菌,將是阻止疾病暴發(fā)的關(guān)鍵存在點。通過查閱文獻(xiàn),2000～2010年這十年間,前增菌的研究幾乎是一個空白,因此,前增菌液的研究將是以后研究的又一重點,其研究的方向有以下幾點。第一,單菌檢測的前增菌液種類繁多,要選定一種對單菌菌屬有增菌效果的增菌液并進(jìn)行改良。第二,共增菌的增菌液仍需要進(jìn)一步研究,達(dá)到最終可以同時富集5種或5種以上菌體。第三,將增菌方法與完善的檢測方法合理的結(jié)合,最終達(dá)到快速檢測的目的。

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Research progress in the pre-enrichment of rapid detection of foodborne pathogenic bacteria

QIAN Hong-mei1,HU Wen-zhong2,*,FENG Ke3,Sa-ren-gao-wa3,SHAO Wen-jun2

(1.College of Food Science,Dalian Polytechnic University,Dalian 116600,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

In recent years,the food poisoning and deaths caused by food-borne pathogens have frequently occurred in the world,serious harm to human health,food-borne microorganisms have become the No.1 killer of human health. At present,the research on the technology of food-borne pathogenic bacteria detection has become a hot spot for international scholars,and the focus of the research is on rapid detection technology. However,in the rapid detection,especially molecular biology techniques,pre-enrichment process is required,how to shorten the pre-enrichment time and improve the enrichment effect is a problem to solve that in the development of rapid detection. In this paper,outbreaks ofSalmonella,Staphylococcusaureus,Listeriamonocytogenes,VibrioparahaemolyticusandShigellaare discussed and focused on the status of the pre-enrichment of first four bacteria,in order to acquaintance the existing of pre-enrichment of rapid detection and achieve a shorter time to detect foodborne pathogens.

food-borne pathogenic bacteria;enrichment culture;rapid detection

2015-12-09

錢紅玫(1991-)，女，在讀碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：qhm171@126.com。

胡文忠(1959- )，男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05)；國家自然科學(xué)基金項目(31172009，31471923)。

TS255.7

A

1002-0306(2016)13-0360-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.066