金 嫻 譚 萍 樊春卉 朱平安 黃曉彤 張艮芳 陳 芳

(廣東省深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院1 檢驗科,2 婦產(chǎn)科,深圳市 518081，電子郵箱：514968029@qq.com)

B族鏈球菌(Group BStreptococcus,GBS)也稱無乳鏈球菌，是導致圍生期感染的重要病原菌。在妊娠晚期，孕婦感染GBS后可導致胎膜早破、流產(chǎn)、絨毛膜羊膜炎、胎兒先天性肺炎及宮內(nèi)死胎等；而新生兒發(fā)生GBS 侵襲性感染可導致重癥肺炎、敗血癥和化膿性腦膜炎等，對孕產(chǎn)婦及新生兒造成嚴重后果[1]。目前，全球范圍內(nèi)GBS的檢出率因地區(qū)、種族差異及檢測方法不一而存在較大差異，其檢出率在5%～30%之間[2-4]。采用直接接種細菌培養(yǎng)法檢測GBS已得到廣泛開展，但是其檢出率低，極易出現(xiàn)漏檢。相關文獻報告，選擇性的肉湯增菌能提高GBS的陽性檢出率[5]，而免疫層析法、PCR法可快速檢測GBS，且檢出率相對較高[4-5]。美國疾病預防控制中心推薦的檢測方法是先對樣本進行增菌，再進行再次培養(yǎng)或者抗原、核酸檢測[6]。但在實際工作中，對樣本增菌后再進行抗原及核酸檢測費時費力，成本高，因此很少采用該方法。本研究結合本院GBS檢測開展情況及相關文獻，比較采用不同方法進行直接檢測及增菌后檢測的檢測效果，為臨床GBS檢測需求提供合理的方案。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年4月至2019年1月在我院產(chǎn)檢的300例孕婦作為研究對象，年齡22～39歲。納入標準：妊娠35～37周。排除1周內(nèi)使用過抗菌藥或陰道周圍外用清洗劑的孕婦，以及合并嚴重心血管、肝、腎及免疫系統(tǒng)疾病的孕婦及病歷資料不全者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有孕婦均知情同意。

1.2 儀器與試劑 儀器：法國梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK2 Compact細菌檢定儀，日本松下公司生產(chǎn)的MCO-18ACx型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國應用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的VIIA 7DX型全自動熒光定量PCR儀。試劑：青島海博生物技術有限公司生產(chǎn)的Todd-Hewitt肉湯(Todd-Hewitt Broth,THB)培養(yǎng)基(批號：20171211)、萘啶酮酸(批號：20171028、20180320)、多粘菌素E(批號：20180221)，鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的血平板(批號：20180308B、20180606B、20180905B)；中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)的GBS核酸檢測試劑盒及陰、陽對照試劑盒(批號：2018001)；北京金沃夫生物工程科技有限公司生產(chǎn)的GBS免疫層析法檢測試劑盒(批號：20170801)。

1.3 標本采集 先擦去外陰分泌物，將無菌陰道拭子小心插入陰道內(nèi)，在陰道下段1/3處旋轉1周采集陰道分泌物，之后將同一根拭子插入肛門，在肛門括約肌上緣2～3 cm 處輕輕旋轉取得直腸分泌物，共采集4根陰道-直腸分泌物樣本。標本采集完成后1 h內(nèi)送實驗室檢測。將1根置于THB培養(yǎng)基，35℃、5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)增菌培養(yǎng)，另3根用于直接檢測。

1.4 細菌培養(yǎng)方法 (1)直接培養(yǎng)：取1根樣本采用三區(qū)劃線法接種于1個血平板，在35℃、5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，若細菌生長不良則繼續(xù)培養(yǎng)至36～48 h。(2)改良培養(yǎng)法：增菌培養(yǎng)18～24 h、36～48 h后，用無菌吸管各取1滴增菌液滴加入血平板上，用三區(qū)劃線法接種。接種后的血平板，在35℃、5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。(3)結果判定：在血平板上可疑GBS菌落為灰白色，外表光滑凸起，具有透光性；對可疑菌落進行生化鑒定，革蘭染色陽性，鏡下呈鏈狀排列，觸酶試驗陰性，協(xié)同溶血試驗陽性，再采用細菌鑒定儀進行檢測以確認。選取梅里埃公司提供的質控菌株無乳鏈球菌ATCC13813和化膿鏈球菌ATCC19615分別作為陽性和陰性對照。

1.5 免疫層析法 (1)直接免疫層析法：在抽提管內(nèi)加入試劑A和試劑B各5滴，將1根樣本拭子插入抽提管中，反復用力旋轉并上下抽提至少10次，靜置10 min，棄去拭子，塞緊滴頭，滴加2～3滴樣本液至試劑卡加樣孔中，10～20 min判斷結果。(2)改良免疫層析法：增菌培養(yǎng)18～24 h、36～48 h后，用無菌吸管各取1 mL增菌液，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入試劑A和試劑B各5滴，混勻后靜置10 min，滴加2～3滴樣本液至試劑卡加樣孔中，10～20 min判斷結果。(3)判斷標準：質控線(C)及檢測線(T)均出現(xiàn)紅色線條判斷為陽性，只有質控線出現(xiàn)紅色線條判定為陰性，只有檢測線出現(xiàn)紅色線條判定為無效。

1.6 PCR法 (1)直接PCR法：取1根樣本拭子并向其中加入1 mL生理鹽水，振蕩混勻后轉移至1.5 mL EP管，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DNA提取液50 μL，100℃裂解10 min，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，取上清5 μL作為模板進行PCR擴增并判定結果。(2)改良PCR法：增菌培養(yǎng)18～24 h、36～48 h后，用無菌吸管各取1 mL增菌液[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min后棄上清，加入DNA提取液50 μL，100℃裂解10 min，[(24±2)℃]下12 000 r/min離心5 min，取上清5 μL作為模板進行PCR擴增并判定結果。(3)判斷標準：FAM通道有擴增曲線且CT值<38判定為陽性；FAM通道有擴增曲線且CT值≥38或者FAM通道無擴增曲線且VIC通道有擴增曲線判定為陰性。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，同一患者樣本直接與改良方法的比較使用McNemar檢驗，細菌培養(yǎng)法、PCR法、層析法之間比較，采用行×列表χ2檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。對于樣本率的兩兩比較，采用Bonferroni法對檢驗水準進行校正，校正后的兩兩比較檢驗水準α=0.017。

2 結 果

2.1 直接細菌培養(yǎng)與增菌后培養(yǎng)法的檢測結果 直接細菌培養(yǎng)法陽性檢出率為2.33%(7/300)，增菌18～24 h、36～48 h后培養(yǎng)陽性檢出率分別為9.33%(28/300)、10.67%(32/300)。增菌18～24 h、36～48 h后培養(yǎng)的陽性檢出率高于直接培養(yǎng)(均P<0.001)，但增菌不同時間后培養(yǎng)的陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.125)，見表1、表2及表3。

表1 直接培養(yǎng)法與增菌18～24 h后細菌培養(yǎng)法的檢測結果比較(n)

表2 直接培養(yǎng)法與增菌36～48 h后細菌培養(yǎng)法的檢測結果比較(n)

表3 增菌18～24 h與36～48 h后細菌培養(yǎng)法的檢測結果比較(n)

2.2 直接PCR法與增菌后PCR法的檢測結果 直接PCR法陽性檢出率為9.00%(27/300)，增菌18～24 h、36～48 h后PCR法陽性檢出率分別為12.67%(38/300)、14.00%(42/300)。增菌18～24 h、36～48 h后PCR法陽性檢出率均高于直接PCR法(均P<0.001)，但增菌不同時間后PCR法的陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.289)，見表4、表5及表6。

表4 直接PCR法與增菌18～24 h后PCR法的檢測結果比較(n)

表5 直接PCR法與增菌36～48 h后PCR法的檢測結果比較(n)

表6 增菌18～24 h與36～48 h后PCR法的檢測結果比較(n)

2.3 直接免疫層析法與增菌后免疫層析法的檢測結果 直接免疫層析法陽性檢出率為5.33%(16/300)，增菌18～24 h、36～48 h后免疫層析法陽性檢出率為13.67%(41/300)、14.67%(44/300)。增菌18～24 h、36～48 h后免疫層析法陽性檢出率均高于直接免疫層析法(均P<0.001)，但增菌不同時間后免疫層析法的陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.250)，見表7、表8及表9。

表7 直接免疫層析法與增菌18～24 h后免疫層析法的檢測結果比較(n)

表8 直接免疫層析法與增菌36～48 h后免疫層析法的檢測結果比較(n)

表9 增菌18～24 h與36～48 h后免疫層析法的檢測結果比較(n)

2.4 3種直接檢測法結果的比較 3種直接檢測方法陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義，其中直接PCR法的陽性檢出率高于直接細菌培養(yǎng)法(P<0.017)，其他方法兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.017)，見表10。

表10 3種直接檢測法結果的比較[n(%)]

2.5 增菌18～24 h后3種檢測法結果的比較 增菌18～24 h后3種檢測方法的陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表11。

表11 增菌18～24 h后3種檢測法結果的比較[n(%)]

3 討 論

GBS感染是臨床發(fā)生率較高的妊娠晚期疾病，已被證實是引起新生兒疾病和死亡的主要原因。妊娠期的臨床篩查是預防GBS感染的有效途徑[7-9]。美國疾病預防與控制中心自1996年至今共發(fā)布了3版妊娠期GBS篩查指南，我國在2010年開始發(fā)布妊娠期GBS篩查指南，指南中的直接接種細菌培養(yǎng)法由于對實驗設備要求不高、容易開展，被廣泛應用于各醫(yī)院[10]。但是已有文獻表明，直接接種細菌培養(yǎng)法陽性檢出率不高，容易出現(xiàn)臨床漏檢[11-12]。而采取先接種選擇性肉湯培養(yǎng)基再轉種血平板的方法，由于耗時長許多醫(yī)院不愿意使用，但是較多研究表明增菌后細菌培養(yǎng)陽性檢出率更高[13-15]。本研究結果顯示，增菌后，無論是細菌培養(yǎng)法、免疫層析法還是PCR法均能獲得比直接檢測更高的陽性檢出率(均P<0.05)，與上述結果相似。這提示使用選擇性肉湯培養(yǎng)基增菌后，確實能夠獲得更高的陽性檢出率。分析主要原因可能是直接培養(yǎng)法中菌種豐富，雜菌的生長覆蓋GBS的生長，加大了檢測難度[16]；其次是標本本身的GBS含量較低，檢測方法靈敏度較低則會造成漏檢，而選擇性肉湯培養(yǎng)基中包含有萘啶酸、多黏菌素等抗菌藥，能夠有效抑制受檢者陰道-直腸樣本中非目標菌種(多數(shù)為革蘭陰性菌)的生長，雖然對GBS也會產(chǎn)生輕度抑制作用，但選擇性肉湯培養(yǎng)基中的鏈球菌生長營養(yǎng)成分可同時有助GBS的生長，更利于檢出。在增菌的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)有的樣本增菌18～24 h后菌液仍清亮，為避免漏檢，我們延長培養(yǎng)時間至36～48 h，然而增菌36～48 h后細菌培養(yǎng)法、免疫層析法及PCR法的陽性檢出率提高并不顯著。因此，為了縮短檢測時限、及時發(fā)出報告，增菌的時間在18～24 h為宜，沒有必要延長增菌時間。但由于樣本量較少，本研究結果也可能存在偏倚，需要加大樣本量進一步研究證實。此外，目前市場上已有商品化的GBS增菌培養(yǎng)基，但其價格較為昂貴，與目前大力提倡的降低醫(yī)用耗材占比的管理目標不相符；而自行配制分裝的增菌培養(yǎng)基方法簡單、經(jīng)濟實惠且增菌質量有保證，能很好地提高GBS的陽性檢出率。因此，筆者認為有必要將選擇性肉湯培養(yǎng)基進行增菌18～24 h作為GBS檢測的常規(guī)步驟。

細菌培養(yǎng)法、免疫層析法及PCR法直接檢測樣本GBS的陽性率分別為2.33%、5.33%、9.00%，其中PCR法的陽性檢出率高于細菌培養(yǎng)法(P<0.017)。這是因為PCR法可以忽略細菌培養(yǎng)法中GBS生長的情況，而且能夠檢出非β型溶血性GBS及協(xié)同溶血試驗陰性的GBS[17]。在細菌培養(yǎng)及鑒定的過程中，只有可疑的菌落才有機會被挑取行協(xié)同溶血試驗及下一步的鑒定，對可疑菌落的選擇及對平板的判讀要求微生物工作者有較高的專業(yè)能力，這也是細菌培養(yǎng)容易造成漏檢的原因之一。而對樣本進行增菌18～24 h后,細菌培養(yǎng)法、免疫層析法及PCR法對GBS的陽性檢出率分別為9.33%、13.67%、12.67%，三者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這可能是因為，增菌后GBS菌量增加，當待測樣本中的GBS顯著增加，超過各方法的檢測靈敏度之后，各檢測方法因靈敏度不同造成的檢測差異即縮小，最終導致三種檢測方法的陽性檢出率相似。

細菌培養(yǎng)法、免疫層析法及PCR法各有其優(yōu)缺點。細菌培養(yǎng)法檢出率相對較低且對工作人員的專業(yè)能力要求較高，但因其可以進一步做藥敏試驗而被廣泛應用，通過增菌可以顯著提高細菌培養(yǎng)法的陽性檢出率，因此筆者認為增菌步驟對于細菌培養(yǎng)法很重要。PCR法靈敏度更高，只需2～3 h即可完成批量檢測，但操作相對復雜，且對實驗設施及場地要求較高，在不具備開展基因擴增實驗室的醫(yī)院無法完成。而免疫層析法雖然檢測靈敏度相對較低，但檢測方法簡單快捷，30 min左右即可完成，且僅需試劑盒及一些簡單的試驗設備，對檢測方法進行改良即檢測前對樣本進行增菌，檢測時對增菌液進行濃縮，能獲得與PCR法相似的陽性檢出率。

綜上所述，檢測前增菌18～24 h均能提高細菌培養(yǎng)法、免疫層析法、PCR法對GBS的陽性檢出率，且前兩種方法可獲得與PCR法相似的陽性檢出率。此外，檢測時對增菌液進行濃縮，能進一步提高免疫層析法對GBS的陽性檢出率，值得臨床推廣應用，尤其是專業(yè)人員專業(yè)能力及設備相對薄弱的基層實驗室。