周晨妍,劉振華,王丹丹,2,李同彪,高啟禹

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，合成生物學(xué)改造工程與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室,河南新鄉(xiāng) 453000;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453000)

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產(chǎn)木聚糖酶畢赤酵母工程菌株構(gòu)建及表達(dá)條件優(yōu)化研究

周晨妍1,劉振華1,王丹丹1,2,李同彪1,高啟禹1

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，合成生物學(xué)改造工程與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室,河南新鄉(xiāng) 453000;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453000)

將黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn43A成熟肽基因插入表達(dá)載體pPIC9K,重組質(zhì)粒SalⅠ線性化后分別電擊轉(zhuǎn)化2種畢赤酵母GS115和KM71,轉(zhuǎn)化液經(jīng)MD平板、G418濃度梯度平板和搖瓶復(fù)篩,獲得兩株重組菌GS115/Xyn43A(Mut+)和KM71/Xyn43A(Muts)。其中GS115/Xyn43A菌株最優(yōu)表達(dá)條件為:甲醇濃度2.0%,接種時間24 h,誘導(dǎo)時間108 h,誘導(dǎo)溫度30 ℃、誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH6.3;KM71/Xyn43A菌株最優(yōu)表達(dá)條件為:甲醇濃度1.75%,接種時間26 h,誘導(dǎo)時間132 h,誘導(dǎo)溫度30 ℃、誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH6.5。在最優(yōu)表達(dá)條件下兩重組菌GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A比酶活力分別可達(dá)139.36、143.29 U/mg。

黑曲霉,畢赤酵母,木聚糖酶,誘導(dǎo)表達(dá)

木聚糖酶作為一種十分重要的水解酶類[1],廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[2-3]。自然界中木聚糖酶的來源非常廣,很多細(xì)菌、真菌、放線菌等都可產(chǎn)生木聚糖酶[4-5]。木聚糖酶種類很多,分布于糖基水解酶GH5,7,8,10,11,16,43,52及62多個家族,目前報道的木聚糖酶主要?dú)w屬于糖基水解酶GH10和GH11兩大家族[6-8],其他家族的木聚糖酶報道偏少。

在前期的研究過程中,已從實(shí)驗(yàn)室保藏的黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S中克隆出木聚糖酶Xyn43A基因,并對其進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析,前期研究發(fā)現(xiàn)它是一種新的木聚糖酶基因,屬于糖基水解酶GH43家族[9]。鑒于畢赤酵母體系表達(dá)異源蛋白的諸多優(yōu)勢[10],本研究將木聚糖酶Xyn43A基因在2種畢赤酵母GS115(Mut+)和KM71(Muts)中表達(dá),并對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,以期為該酶后續(xù)重組酶酶學(xué)性質(zhì)測定及結(jié)構(gòu)與功能研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

pMD18-T-xyn43A重組載體由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存;E.coliDH5α、表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K及畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115(Mut+)和KM71(Muts)Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4DNA連接酶TaKaRa公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒Sangon公司;G418、無氨基酵母氮源(YNB)Amresco公司;樺木木聚糖Sigma公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)所用酵母培養(yǎng)基YPD、MD、BMGY、BMMY的配制方法均參照Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊。

梯度PCR擴(kuò)增儀(C1000)；電轉(zhuǎn)化儀(Gene PulserⅡ)美國BIO-RAD公司;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-2)北京市六一儀器廠;低溫恒溫槽(DC-0506)上海比朗儀器有限公司;恒溫振蕩器(HZQ-F160A)上海一恒科學(xué)儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 23R)上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)xyn43A基因序列(Genbank:JQ700383)及pPIC9K表達(dá)載體上多克隆位點(diǎn)的特點(diǎn),設(shè)計以下引物:正向引物PC:5′-CCGGAATTCAATCCCGTC TTCCCCGGCT-3′(EcoRⅠ);PZ:5′-ATAAGAAT GCGGCCGCCTACGATACGATAAAGTCCTCC-3′(NotⅠ)。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

以重組質(zhì)粒pMD18-T-xyn43A為模板,PC、PZ為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為:94 ℃反應(yīng)2 min;94 ℃ 30 s變性,67 ℃ 30 s退火,72 ℃ 1 min延伸,進(jìn)行26個循環(huán);72 ℃ 10 min延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pPIC9K表達(dá)載體酶切、連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,陽性克隆子篩選后,提取質(zhì)粒經(jīng)酶切及PCR驗(yàn)證,最終獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-xyn43A。

1.3重組畢赤酵母的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

參照Invitrogen公司操作手冊,重組質(zhì)粒pPIC9K-xyn43A經(jīng)SalⅠ線性化,膠回收后分別電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115和KM71。轉(zhuǎn)化液涂布MD平板,篩選出His+克隆子,接種YPD培養(yǎng)基平板,這些平板含有不同濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mg/mL)的G418,30 ℃培養(yǎng)3～5 d,篩選出的高拷貝轉(zhuǎn)化子,經(jīng)搖瓶復(fù)篩后,最終獲得兩株重組畢赤酵母菌株,分別標(biāo)記為:P.pastorisGS115/Xyn43A,P.pastorisKM71/Xyn43A。

1.4重組畢赤酵母工程菌株的表達(dá)條件優(yōu)化

1.4.1基本表達(dá)條件挑取P.pastorisGS115/Xyn43A,接種于含有20 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中(對于P.pastorisKM71/Xyn43A,挑取單菌落接種于含有50 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL的三角瓶中),30 ℃,250 r/min培養(yǎng)24 h,離心收集菌體,轉(zhuǎn)接至裝有20 mL BMMY培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng),每24 h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為0.5%,誘導(dǎo)表達(dá)6 d。

1.4.2單因素實(shí)驗(yàn)在基本表達(dá)條件的基礎(chǔ)上分別調(diào)整培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36 ℃);誘導(dǎo)前種齡(12、16、20、24、28、32、36 h);BMMY培養(yǎng)基初始pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5);甲醇誘導(dǎo)濃度(0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%);誘導(dǎo)表達(dá)時間(24、48、72、96、120、144、168 h)。

1.4.3正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇單因素中對工程菌酶產(chǎn)量影響較大的幾個因素設(shè)計因素水平表(表1)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),得到最佳表達(dá)條件。

表1　L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.5測定方法

1.5.1細(xì)胞光密度(A600)的測定以空白培養(yǎng)基為對照,菌液稀釋后于波長600 nm下比色測定,A600=OD值×稀釋倍數(shù)。

1.5.2木聚糖酶酶活力的測定木聚糖酶活力測定采用改進(jìn)的DNS法[11]。1個酶活力單位(1 U)定義為:在pH5.0、50 ℃的反應(yīng)條件下,以0.5%樺木木聚糖為底物,每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖所需要的酶量。

測定蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法[12],標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白。蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.4200x+0.0328,R2=0.9997。

木聚糖酶比酶活力(U/mg)=酶活力/蛋白質(zhì)濃度

1.6數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD%),用Sigmaplot軟件繪制曲線圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果單向方差分析(方差)由Student-Newman-Keuls用SPSS17.0檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以PC、PZ為引物,pMD18-T-xyn43A為模板,PCR擴(kuò)增可得到xyn43A基因。以正確的讀碼框?qū)yn43A基因插入到表達(dá)載體pPIC9K中,獲得重組表達(dá)載體pPIC9K-xyn43A(圖1),該載體經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切及PC、PZ引物PCR驗(yàn)證(圖2),最后經(jīng)測序檢驗(yàn)重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1　重組表達(dá)載體pPIC9K-xyn43A的構(gòu)建圖譜Fig.1　Construction of recombinant plasmid pPIC9K-xyn43A

圖2　重組表達(dá)載體pPIC9K-xyn43A的酶切和PCR驗(yàn)證Fig.2　Verification of recombinant plasmidpPIC9K-xyn43A by restriction analysis and PCR注:1:pPIC9K-xyn43A雙酶切產(chǎn)物;2:xyn43A PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M:DNA Marker。

2.2重組畢赤酵母的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

重組表達(dá)載體pPIC9K-xyn43A經(jīng)SalⅠ線性化后,分別電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌GS115和KM71,轉(zhuǎn)化液涂布MD平板,篩選His+轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種于含不同濃度G418的YPD平板,將6.0 mg/mL G418 YPD平板上的重組菌株,經(jīng)搖瓶復(fù)篩,最終篩選到兩株木聚糖酶表達(dá)量較高的工程菌株,分別記作P.pastorisGS115/Xyn43A(Mut+),P.pastorisKM71/Xyn43A(Muts),初始重組酶活力分別為:12.9、13.4 U/mg。

2.3重組畢赤酵母工程菌株的表達(dá)條件優(yōu)化

2.3.1甲醇誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化畢赤酵母中有兩個基因AOX1、AOX2,編碼乙醇氧化酶,AOX1受甲醇專一性誘導(dǎo)且能高水平表達(dá)。只有當(dāng)AOX1基因受到抑制或損傷而不能正常表達(dá)時,AOX2才會進(jìn)行低水平的表達(dá)。在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上,含有AOX1基因的酵母菌株生長表現(xiàn)為正常野生型(Mut+),如果AOX1基因被替換或者被破壞,只有AOX2基因起作用的菌株利用甲醇的能力減弱,則表現(xiàn)為生長緩慢型(Muts)。為系統(tǒng)研究木聚糖酶Xyn43A基因在畢赤酵母中的表達(dá)情況,本研究選擇2種畢赤酵母GS115(Mut+)和KM71(Muts)作為表達(dá)宿主[13]。

圖3結(jié)果顯示,GS115/Xyn43A、KM71/Xyn43A兩株重組菌的甲醇最佳誘導(dǎo)濃度分別為2.0%、1.5%。以醇氧化酶啟動子啟動外源基因表達(dá)的畢赤酵母,在碳源只有甘油的BMGY培養(yǎng)基中,甲醇氧化酶AOX1不會產(chǎn)生,外源基因也不會表達(dá)[13]。在BMMY培養(yǎng)基中畢赤酵母只能以甲醇作為碳源,一方面會表達(dá)醇氧化酶來利用甲醇[14],且醇氧化酶基因在木聚糖酶基因的上游,所以木聚糖酶的表達(dá)與醇氧化酶的表達(dá)成正比關(guān)系;另一方面,甲醇既可作為酵母的碳源也可作為誘導(dǎo)物,因此,在一定范圍內(nèi)提高甲醇的濃度可能會增加外源蛋白的表達(dá)量,但是,添加過量,甲醇對酵母生長也會產(chǎn)生毒害作用[15]。

圖3　誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化Fig.3　Optimization of methanolconcentration for xylanase expression

2.3.2誘導(dǎo)前種齡的優(yōu)化外源蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)可分為兩個階段:第一階段為生長階段,在含有甘油的BMGY培養(yǎng)基中生長,使A600達(dá)到一定數(shù)值時停止培養(yǎng),并離心收集菌體;第二階段為誘導(dǎo)表達(dá)階段,將收集來的菌體重新轉(zhuǎn)入含有誘導(dǎo)劑甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)。在重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過程中,種子的選擇非常關(guān)鍵。在摸索誘導(dǎo)前最佳接種時間前,先測定了GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A兩株菌的生長曲線。由圖4可以看出,對于兩株重組菌來講,20～36 h左右的菌體濃度成對數(shù)生長趨勢,為對數(shù)生長期。

圖4　重組菌生長曲線Fig.4　Growth curves of recombinant P. pastoris

根據(jù)生長曲線所揭示的信息,優(yōu)化了誘導(dǎo)前兩株菌的種齡,圖5結(jié)果顯示對于GS115/Xyn43A、KM71/Xyn43A 兩株重組菌株來說,種齡分別為24、28 h時重組酶比酶活力最高。這可能由于在一定時間范圍內(nèi),隨著生長時間的延長,菌體生長量增加,表達(dá)量也會增加,但是時間過久,菌體老化,不利于外源蛋白的表達(dá)。

圖5　種齡的優(yōu)化Fig.5　Optimization of the inoculationtime for xylanase expression

2.3.3誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基pH的優(yōu)化pH不僅能夠影響酶的活性,使菌體的新陳代謝受阻;還能夠影響細(xì)胞膜的通透性,進(jìn)一步影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及代謝物的排泄;此外,pH還能夠通過影響培養(yǎng)基中某些成分與中間代謝物的解離來影響微生物對這些物質(zhì)的利用[16]。圖6結(jié)果顯示:GS115/Xyn43A、KM71/Xyn43A兩株重組菌分別在pH為6.0、6.5時重組酶酶活力最高。

表2　L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

圖6　誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基pH的優(yōu)化Fig.6　Optimization of pH for xylanase expression

2.3.4甲醇誘導(dǎo)時間的優(yōu)化同一木聚糖酶基因在不同的宿主菌中表達(dá)水平的高低與誘導(dǎo)時間關(guān)系非常大。誘導(dǎo)時間過短時,誘導(dǎo)劑還未充分發(fā)揮作用,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)并未大量消耗,目的蛋白表達(dá)量少,比酶活力較低;誘導(dǎo)時間過長,培養(yǎng)液pH會發(fā)生明顯改變,并且隨著營養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗,目的蛋白的表達(dá)將會受阻,導(dǎo)致培養(yǎng)液中目的酶比酶活力下降。圖7結(jié)果顯示,GS115/Xyn43A、KM71/Xyn43A的最佳甲醇誘導(dǎo)時間分別為120、144 h。

圖7　甲醇誘導(dǎo)時間的優(yōu)化Fig.7　Optimization of the induction time for xylanase expression

2.3.5培養(yǎng)溫度的優(yōu)化溫度對微生物生長的影響主要表現(xiàn)在兩個方面:一方面,隨著環(huán)境溫度升高,微生物細(xì)胞中的酶活力增強(qiáng),生物化學(xué)反應(yīng)加快,生長速率提高;另一方面,隨著溫度上升,微生物細(xì)胞中對溫度較敏感的組成部分如蛋白質(zhì)、核酸等會受到不可逆的破壞[17]。圖8結(jié)果顯示,GS115/Xyn43A、KM71/Xyn43A兩株重組菌最適培養(yǎng)溫度均為30 ℃。

表3　L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方差分析

圖8　培養(yǎng)溫度的優(yōu)化Fig.8　Optimization of temperature for xylanase expression

2.3.6L9(34)正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對兩株重組菌的培養(yǎng)基初始pH、種齡、甲醇濃度和誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。表2極差分析結(jié)果顯示,四種因素對于GS115/Xyn43A產(chǎn)酶影響大小而言,誘導(dǎo)時間>種齡>甲醇濃度>pH,最優(yōu)的培養(yǎng)組合是pH6.3、種齡24 h、甲醇濃度2.0%,誘導(dǎo)時間是108 h;對于KM71/Xyn43A來說,種齡>誘導(dǎo)時間>甲醇濃度>pH,最優(yōu)的培養(yǎng)組合是pH6.5、種齡26 h、甲醇濃度1.75%,誘導(dǎo)時間是132 h。

方差分析結(jié)果表3顯示,四種誘導(dǎo)因素的F值均小于p=0.05時的F臨界值,說明四種因素對重組酶的影響沒有顯著性差異。

將兩株重組菌在最優(yōu)水平上進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),比酶活力分別為139.36、143.29 U/mg。

3　結(jié)論

黑曲霉木聚糖酶Xyn43A基因在2種畢赤酵母GS115(Mut+)和KM71(Muts)中成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá),通過G418濃度梯度平板初篩及搖瓶復(fù)篩,獲得兩株木聚糖酶工程菌株P(guān).pastorisGS115/Xyn43A(Mut+),P.pastorisKM71/Xyn43A(Muts)。搖瓶條件下GS115/Xyn43A菌株最優(yōu)表達(dá)條件為:甲醇濃度2.0%,種齡24 h,誘導(dǎo)時間108 h,培養(yǎng)溫度30 ℃,誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH6.3;KM71/Xyn43A菌株最優(yōu)表達(dá)條件為:甲醇濃度1.75%,種齡26 h,誘導(dǎo)時間132 h,培養(yǎng)溫度30 ℃,誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH6.5。兩重組菌GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A比酶活力分別可達(dá)139.36、143.29 U/mg。

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Study on the construction and expression of the engineered strain ofPichiapastorisfor xylanase production

ZHOU Chen-yan1,LIU Zhen-hua1,WANG Dan-dan1,2,LI Tong-biao1,GAO Qi-yu1

(1.School of Life Science and Technology,Xinxiang Medical University,Synthetic Biology Remaking Engineering and Application Laboratory,Xinxiang 453003,China;2.San Quan Medlcal College,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China)

A gene encoding xylanase Xyn43A fromAspergillusnigerXZ-3S was cloned into thePichiapastorisexpression vector,pPIC9K. The recombinant plasmid was linearized withSalI and then transformed intoPichiapastorisGS115 and KM71 by electroporation,respectively. After screening by MD medium,G418 concentration plate and shake bottle selection,two recombinant strains GS115/Xyn43A and KM71/Xyn43A were obtained. The best optimization schemes were obtained by single factor experiment and L9(34)experiment. The optimal expression conditions of GS115/Xyn43A were methanol concentration of 2.0%,inoculation time of 24 h,induction time of 108 h,induction temperature of 30 ℃,and initial pH6.3. The optimal expression conditions of KM71/Xyn43A were methanol concentration of 1.75%,inoculation time of of26 h,induction time of 132 h,induction temperature of 30 ℃,and initial pH6.5. Under the optimum conditions,the xylanase activity of the two recombinant strains were 139.36 U/mg and 143.29 U/mg,respectively.

Aspergillusniger;Pichiapastoris;xylanase;induction expression

2015-12-16

周晨妍(1979-)，女，博士，副教授，從事微生物酶工程研究，E-mail:zhouchenyan2008@163.com。

河南省科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目(162102210118)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A180861；14A180018)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃項(xiàng)目(2011GGJS-125)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目培育基金(2013ZD113)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)13-0162-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.024