紀明華,趙利超,史吉平,孫俊松,*

(1.中國科學院上海高等研究院,上海 201210;2.中國科學院大學，北京 100049;3.上海大學,上海 200444)

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一種芽孢桿菌中性蛋白酶啟動子的克隆和驗證

紀明華1,2,趙利超1,3,史吉平1,孫俊松1,*

(1.中國科學院上海高等研究院,上海 201210;2.中國科學院大學，北京 100049;3.上海大學,上海 200444)

為研究1398中性蛋白酶高效表達的分子機制,對其生產(chǎn)菌株進行了基因組測序和比對,確認了表達該中性蛋白酶的操縱子序列及結(jié)構(gòu)。通過構(gòu)建1398中性蛋白酶表達質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌;以gfp為報告基因,將包含P1398在內(nèi)的不同啟動子分別構(gòu)建到質(zhì)粒pMK4,轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌。發(fā)酵研究結(jié)果表明:P1398是一種底物自發(fā)誘導的高效啟動子,是菌株表達1398中性蛋白酶的關鍵因素。1398中性蛋白酶在枯草芽孢桿菌中可獲得穩(wěn)定的表達量,其中在164中活性最高(1210 U/mL);重組枯草芽孢桿菌在LB中培養(yǎng)時,P1398介導的GFP的表達量低于P43和PxylA,而在工業(yè)培養(yǎng)基PPB中,其表達量為PxylA介導的GFP的2.14倍。因此,P1398可用于食品工業(yè)酶重組生產(chǎn)菌株的構(gòu)建。

解淀粉芽孢桿菌,中性蛋白酶,啟動子,gfp

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一類與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)近緣的芽孢桿菌[1],關于解淀粉芽孢桿菌的研究主要集中在菌種分離純化及代謝產(chǎn)物特性分析,尤其是抑菌性能方面的研究[2-5]。雖然已經(jīng)公布了一些解淀粉芽孢桿菌的基因組測序數(shù)據(jù)[1,6-8],但是對其蛋白表達的分子機制的研究報道不多。

解淀粉芽孢桿菌被認定為安全(Generally Recognized As Safe,GRAS)的微生物,由于外源DNA的轉(zhuǎn)化效率過低,其分子改造十分困難,因此該類菌株目前難以用作重組生產(chǎn)菌株;而枯草芽孢桿菌具有遺傳操作工具豐富、遺傳背景清晰、蛋白分泌量高等優(yōu)點,是許多外源分泌蛋白高水平表達的首選宿主細胞[9]。在外源蛋白的重組表達構(gòu)建時,選擇轉(zhuǎn)錄水平高的啟動子是重要因素之一;已經(jīng)應用于枯草芽孢桿菌中的成熟啟動子主要有P43、PamyQ、Pspac、PxylA等,這些啟動子在實驗室的富集培養(yǎng)基中表現(xiàn)良好,但鮮見它們被用于酶制劑蛋白的放大生產(chǎn),它們還存在需使用誘導物、高培養(yǎng)成本或表達效率不高等缺點。

本研究前期研究發(fā)現(xiàn),我國廣泛用于生產(chǎn)中性蛋白酶的1398芽孢桿菌[10],其中性蛋白酶產(chǎn)量極高,因此對其開展了分子機理的研究。通過分子生物學手段分析發(fā)現(xiàn)1398蛋白酶生產(chǎn)菌株為解淀粉芽孢桿菌,經(jīng)全基因組測序及序列比對后確認了表達中性蛋白酶(nprE)的操縱子(operon)結(jié)構(gòu)及序列,并通過克隆表達驗證了該操縱子的功能。為進一步了解1398 NprE啟動子P1398的轉(zhuǎn)錄特性,以gfp為報告基因,并以啟動子PxylA和P43為對照,在不同培養(yǎng)基中進行了重組菌株發(fā)酵的研究。

表1　菌株和質(zhì)粒

表2　引物列表

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株與質(zhì)粒見表1,芽孢桿菌菌株包括解淀粉芽孢桿菌1398和枯草芽孢桿菌1A976(SCK6)、168和164(ATCC 6051a)。其中,1398芽孢桿菌來自白銀賽諾生物科技有限公司,164購自美國ATCC菌種保藏中心,168及1A976[11]由BGSC贈予。

基因組DNA提取試劑盒、PCR清潔試劑盒、質(zhì)粒小劑量提取試劑盒等杭州愛思進生物技術(shù)有限公司;DNA聚合酶Prime STAR、DNAligase等TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶Pst I、EcoR I、BamH I、Xma I等及其體系Thermo Scientific;木糖、干酪素等國藥集團化學試劑有限公司。

Synergy H1型酶標儀美國BioTek公司;DU-730型分光光度計美國Beckman Coulter公司。

1.2實驗方法

1.2.1引物設計與PCR所擴增DNA片段、對應模板及引物見表2。PCR所用DNA聚合酶為Prime STAR,PCR基本程序如下:預變性98 ℃ 2 min;變性98 ℃ 10 s;退火55 ℃ 10 s;延伸72 ℃,1 kb/min。

1.2.2培養(yǎng)基的配制菌體活化、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基,100 mL LB組成為1 g NaCl、1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母浸取物;發(fā)酵用蛋白酶生產(chǎn)培養(yǎng)基(Protease producing broth,PPB),100 mL蛋白酶生產(chǎn)培養(yǎng)基組成為6.5 g玉米粉、4 g豆粕、5.5 g麩皮、0.3 g Na2HPO4·12H2O、0.03 g KH2PO4;枯草芽孢桿菌1A976誘導轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為含1%(w/v)木糖的LB培養(yǎng)基。用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選的氨芐青霉素(Amp)濃度為100 μg/mL;用于枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子篩選的氯霉素(Cm)濃度為10 μg/mL。

1.2.31398芽孢桿菌基因組的提取、測序及表達質(zhì)粒的構(gòu)建接種1398芽孢桿菌單菌落于3 mL LB培養(yǎng)液中,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)10～12 h,離心10000×g,1 min,收集菌體,以AxyGEN基因組DNA提取試劑盒及其方法提取基因組DNA。1398芽孢桿菌的基因組測序服務由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。芽孢桿菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建均基于pMK4,目標產(chǎn)物由PCR擴增獲得,再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,質(zhì)粒提取后由上海生工生物工程有限公司測序驗證。

1.2.4感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化大腸桿菌的轉(zhuǎn)化采用氯化鈣法[12]。164和168采用電擊轉(zhuǎn)化方法[13];1A976在參照原方法[11]的基礎上有少量改變,具體方法如下:單菌落1A976接種到3 mL LB試管中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10～12 h;取300 μL轉(zhuǎn)接到預熱的3 mL LB試管中,加入過濾除菌的的木糖溶液至木糖終濃度為1%,37 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)3 h后分裝到2 mL離心管中,然后加入待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；靹?37 ℃、200 r/min混合培養(yǎng)1.5 h后涂含有相應抗生素的LB瓊脂平板培養(yǎng)。

1.2.5質(zhì)粒的提取大腸桿菌質(zhì)粒的提取采用AxyPrep質(zhì)粒小劑量提取試劑盒中的方法?？莶菅挎邨U菌的質(zhì)粒提取在試劑盒方法的基礎上有所改變,即用Buffer S1懸浮細胞后,加入50 mg/mL的溶菌酶20 μL,混勻,把體系置于37 ℃水浴鍋內(nèi)反應30 min,然后加入Buffer S2,其他操作步驟不變。

1.2.6中性蛋白酶酶活測定按照QB/T1803-1993標準進行,1個酶活單位(U)定義為1 min內(nèi),水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量。采用紫外分光光度法,以干酪素為底物,用三氯乙酸終止反應,在275 nm處檢測吸光度。具體如下:取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液,根據(jù)酶活性梯度稀釋到一定倍數(shù)后,取2 mL酶稀釋液在(30±0.2) ℃水浴鍋中預熱2 min,然后加入10 g/L酪素溶液2.00 mL,搖勻,在(30±0.2) ℃水浴中反應10 min。再加入0.4 mol/L三氯乙酸4.00 mL,搖勻。最后靜止10 min后用中性濾紙過濾,取濾液用10 mm比色皿于275 nm處檢測吸光度,由OD275值計算酶活。

1.2.7細胞培養(yǎng)與GFP熒光檢測枯草芽孢桿菌的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)如下:單克隆菌落接種到3 mL LB培養(yǎng)液,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h,然后以1%的體積比接種到含有50 mL培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中,30 ℃,200 r/min連續(xù)培養(yǎng),每12 h取一次發(fā)酵液樣品。

細胞發(fā)酵液經(jīng)梯度稀釋后用于GFP的熒光檢測,200 μL經(jīng)10倍,100倍稀釋后的菌液置于96孔板中,利用酶標儀進行熒光測定:測量時選擇熒光檢測模式,讀數(shù)類型選擇“endpoint”,設定激發(fā)光波長為485 nm,檢測光波長為520 nm,設定測量溫度為30 ℃。

2　結(jié)果與分析

2.11398芽孢桿菌的菌種鑒定及中性蛋白酶操縱子的鑒定

對1398中性蛋白酶高效表達的分子機制進行研究,首先要獲取編碼該蛋白酶的完整操縱子結(jié)構(gòu)及序列。在以前的研究中已經(jīng)通過同源基因獲得了編碼該中性蛋白酶的ORF序列,并通過質(zhì)譜方法驗證了其氨基酸序列[15];但是不能成功擴增表達該蛋白酶的完整操縱子序列,猜測是其啟動子序列與已發(fā)布的枯草芽孢桿菌基因組序列同源性不高,因此進行了1398芽孢桿菌的全基因組測序。該測序不僅獲得了編碼1398 NprE的完整操縱子序列,同時也獲取了完整的16S rDNA序列,經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)該生產(chǎn)菌株不是先前報道中的枯草芽孢桿菌[16-17],而是解淀粉芽孢桿菌,如圖1所示。

圖1　以16S rDNA序列鑒定產(chǎn)1398 NprE的芽孢桿菌的種屬關系Fig. 1　16S rDNA analysis of 1398 NprE producing bacillus

從圖1可以看出,解淀粉芽孢桿菌屬與枯草芽孢桿菌屬由共同的原始菌株進化而來,相對于研究比較透徹的解淀粉芽孢桿菌DSM7[14],該1398工業(yè)生產(chǎn)菌株與枯草芽孢桿菌168的種屬關系更為接近。

完整的1398中性蛋白酶的操縱子結(jié)構(gòu)如圖2所示?？梢钥闯?1398中性蛋白酶的操縱子由啟動子P1398,信號肽Signal peptide,中性蛋白酶的完整nprE基因序列,以及可能的轉(zhuǎn)錄終止子序列組成。

圖2　1398中性蛋白酶操縱子示意圖Fig. 2　Schematic diagram of 1398 nprE operon注:P1398,1398中性蛋白酶啟動子;SP,signal peptide,信號肽;ME,mature enzyme,成熟肽;terminator,終止子。

2.21398中性蛋白酶基因的異源表達

圖3　1398中性蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的表達Fig.3　Expression of 1398 nprE in B.subtilis注:a,pMK4-1398nprE構(gòu)建流程。1398nprE經(jīng)Pst I/Nde I雙酶切后連接到pMK4相應位點,在大腸桿菌中得到缺失一個A堿基的質(zhì)粒,以P10/P11引物PCR后轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌后校正突變;b,枯草芽孢桿菌提取質(zhì)粒pMK4-1398nprE電泳圖。M:DNA Marker,mut:pMK4-1398nprE-Mut,1:所提取1A976的質(zhì)粒,2:所提取168的質(zhì)粒,3:所提取164的質(zhì)粒;c,重組菌株1A976/168/164發(fā)酵產(chǎn)1398中性蛋白酶活性。pMK4:空白質(zhì)粒對照組,pMK4-1398nprE:實驗組。

為進一步驗證測序所得到的1398中性蛋白酶操縱子的功能,同時也出于解決原始菌株所產(chǎn)酶制品存在的粘度高,不易分離,酸臭味大等問題的技術(shù)需求,開展了NprE在枯草芽孢桿菌的重組表達。如圖3所示,本研究首先嘗試利用酶切克隆的方法構(gòu)建表達1398 NprE的穿梭質(zhì)粒pMK4-1398nprE,但是從大腸桿菌始終提取不到含有正確序列的質(zhì)粒,只得到一些帶有閱讀框移碼突變的質(zhì)粒pMK4-1398nprE-Mut。有文獻報道,中性蛋白酶的表達對于大腸桿菌具有致死效應[18-20],因此猜測可能是由于這一效應導致pMK4-1398nprE無法在大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建成功。為驗證這個猜想,設計了用于修正點突變的引物,以pMK4-1398nprE-Mut質(zhì)粒DNA為模板,進行移碼突變和修正,然后直接將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化} 1A976。從1A976轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒并測序驗證,最終獲得了不含突變的表達質(zhì)粒pMK4-1398nprE,如圖3(a)和圖3(b)所示;而將pMK4-1398nprE再次轉(zhuǎn)化DH5α,還是得不到相應的大腸桿菌抗性菌株,從而基本可以證明,1398 NprE操縱子序列可以在大腸桿菌內(nèi)獲得轉(zhuǎn)錄和表達,但該表達產(chǎn)物可能由于不能被有效分泌,因此會在宿主大腸桿菌細胞內(nèi)產(chǎn)生負效應,抑制菌株增殖。

表達質(zhì)粒pMK4-1398nprE之后又被分別轉(zhuǎn)入B.subtilis164、168,以分別轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pMK4的三種重組枯草芽孢桿菌菌株為空白對照組。利用蛋白酶工業(yè)生產(chǎn)PPB培養(yǎng)基分別進行了搖瓶發(fā)酵和重組酶活的測定,實驗發(fā)現(xiàn),重組1398 NprE的酶活在48 h左右達到最大值。

圖3(c)為6株菌發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的酶活測定結(jié)果,從圖3(c)可以看出,pMK4空白對照組相對于實驗組中性蛋白酶表達水平很低,攜帶質(zhì)粒pMK4-1398nprE的不同枯草芽孢桿菌均能表達中性蛋白酶,但是存在明顯的宿主差異性,其中,在164中1398 NprE的酶活水平最高,約為1210 U/mL發(fā)酵液,高出1A976重組菌株發(fā)酵水平的1倍以上,比168的發(fā)酵酶活高出約50%。上述研究結(jié)果表明所克隆的1398 nprE operon在枯草芽孢桿菌中具有轉(zhuǎn)錄活性。

2.3表達GFP的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

圖4　重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 4　Construction of plasmid注:a,pMK4-gfp、pMK4-PxylA-gfp、pMK4-P1398-gfp、pMK4-P43-gfp構(gòu)建流程;b,質(zhì)粒酶切電泳驗證。M:DNA Marker,1:pMK4,2:BamH I/EcoR I雙酶切pMK4-gfp,3:Pst I/EcoR I雙酶切pMK4-PxylA-gfp,4:Pst I/EcoR I雙酶切pMK4-P43-gfp,5:Pst I/EcoR I雙酶切pMK4-P1398-gfp。

為進一步探究1398中性蛋白酶高表達的分子機制,如圖4(a)所示,gfp基因被分別構(gòu)建到啟動子P1398、PxylA以及P43之后,分別得到質(zhì)粒pMK4-P1398-gfp、pMK4-PxylA-gfp以及pMK4-P43-gfp,pMK4-gfp為不含啟gfp基因的動子的對照質(zhì)粒。pMK4與gfp片段經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切,T4 DNA連接酶連接得到pMK4-gfp;pMK4與DNA片段PxylA-gfp經(jīng)PstI單酶切,T4 DNA連接酶連接得到pMK4-PxylA-gfp;pMK4-PxylA-gfp與P1398經(jīng)PstI、XmaI酶切酶連得到pMK4-P1398-gfp;pMK4-PxylA-gfp與P43經(jīng)PstI、XmaI酶切酶連則得到pMK4-P1398-gfp。質(zhì)粒構(gòu)建過程中,除pMK4-gfp外,pMK4-P1398-gfp、pMK4-PxylA-gfp以及pMK4-P43-gfp在大腸桿菌中均能表達GFP,菌落在可見光下呈現(xiàn)綠色,再次驗證啟動子P1398在大腸桿菌中有轉(zhuǎn)錄功能。圖4(b)為4個質(zhì)粒的酶切電泳圖,經(jīng)測序確認質(zhì)粒序列無誤。把pMK4-gfp、pMK4-P1398-gfp、pMK4-PxylA-gfp以及pMK4-P43-gfp分別轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌1A976中,即得到4株重組枯草芽孢桿菌。

2.4不同啟動子介導GFP表達的發(fā)酵培養(yǎng)研究

為了展開對該啟動子在枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中的表達特性研究,對含有pMK4-gfp、pMK4-P1398-gfp、pMK4-PxylA-gfp以及pMK4-P43-gfp的4株重組菌分別利用實驗室常規(guī)營養(yǎng)富集培養(yǎng)基LB及蛋白酶工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基PPB進行搖瓶發(fā)酵實驗,發(fā)酵過程中對GFP的熒光強度進行檢測,結(jié)果如圖5所示。

圖5　綠色熒光蛋白在(a)LB和(b)中性蛋白酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中的表達Fig. 5　Expression of GFP in(a)Lysogeny broth and(b)protease producing broth注:圖中熒光量(Fluorescence intensity)為發(fā)酵液稀釋100倍后測定結(jié)果。

從圖5可以看出,在LB和PPB中,三種啟動子均能啟動gfp的表達。如圖5(a)所示,利用LB進行菌株的發(fā)酵培養(yǎng)時,P1398啟動子引導的GFP表達水平明顯不如其它兩種啟動子,但是在蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)的工業(yè)培養(yǎng)基PPB中,P1398轉(zhuǎn)錄表達的GFP熒光值持續(xù)升高(圖5(b))。在前24 h內(nèi),P1398-GFP的表達量不如PxylA-GFP;而在48 h時,P1398-GFP的表達量比PxylA-GFP高19%,比P43-GFP高48%;待菌株連續(xù)發(fā)酵到84 h,P1398-GFP的表達量比PxylA-GFP高59%,比P43-GFP高88%;在120 h,P1398-GFP的表達量比PxylA-GFP和P43-GFP分別高出114%和65%。上述結(jié)果表明,相對廉價的工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基PPB對P1398有明顯的誘導表達效應。

3　結(jié)論

本研究基于16S rDNA比對分析發(fā)現(xiàn)1398不是傳統(tǒng)認為的枯草芽孢桿菌,而是一種解淀粉芽孢桿菌;從1398解淀粉芽孢桿菌中克隆出的1398nprEoperon(DDBJ/EMBL/GenBank accession no. KU312310),在大腸桿菌中直接表達對宿主具有明顯的致死效應;1398解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶基因可在枯草芽孢桿菌中異源表達,表達量約為1210 U/mL發(fā)酵液;本研究首次報道了一種新型啟動子P1398,其具有底物自發(fā)誘導效應,對菌株1398高產(chǎn)中性蛋白酶有重要作用,以GFP為報告蛋白進行分析時,在粗放培養(yǎng)基中其效率是PxylA的2.14倍。

因此啟動子P1398具有良好的應用前景,本研究將繼續(xù)對該啟動子展開突變和優(yōu)化工作,并將其用于食品加工領域各類酶制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)菌株的分子構(gòu)建研究。

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JI Ming-hua1,2,ZHAO Li-chao1,3,SHI Ji-ping1,SUN Jun-song1,*

(1.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3.Shanghai University,Shanghai 200444,China)

To obtain the DNA elements responsible for transcriptional regulation of the gene expressing 1398 neutral protease(nprE),the genome sequencing of the native bacillus strain was performed and analyzed,the complete operon including upstream region of the possible location of 1398nprEcassette was introduced intoB.subtilisfor heterologous expression.gfpwas then used as the reporter gene for full investigation of the promoter of 1398nprE(P1398)and was compared with known promoter PxylAand P43. It was found that,P1398 was an efficient and substrate-induced promoter as well as a key factor in the expression of 1398 NprE. Stable expression of 1398 NprE inB.subtiliswas detected and the highest enzyme activity was 1210 U/mL in 164. Compared with PxylAand P43,the advantage of P1398 was its capability of bringing better yield of GFP protein inB.subtiliswith medium used for industrial production of enzymes,the GFP level was 214% of that mediated by PxylA,therefore,P1398 was a good candidate of promoter choice for construction of recombinant enzymes’ production using Bacillus.

B.amyloliquefaciens;neutral protease;promoter;gfp

2016-01-14

紀明華(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物代謝工程,E-mail：15227257110@163.com。

孫俊松(1974-)男，博士，研究員，研究方向：酶工程與生物化工，E-mail：sunjs@sari.ac.cn。

上海市科技攻關計劃項目(15295810600)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)13-0192-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.030