汪水呈,曾維偉,陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇南京 210095)

?

Surfactin抑菌穩(wěn)定性及其在米飯和面包中的應(yīng)用

汪水呈,曾維偉,陸兆新*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇南京 210095)

本文研究了溫度、pH、紫外、糖、鹽對Surfatin抑菌效果的影響以及其在米飯和面包中的初步應(yīng)用。結(jié)果表明:在弱酸性條件下,Surfatin的抑菌活性隨溫度變化不大,pH6,100 ℃處理20 min,對藤黃微球菌的抑菌圈由17.52±0.22 mm變?yōu)?6.44±0.03 mm;而在堿性條件下,高溫處理使其嚴(yán)重失活,在pH8,60℃處理20 min,抑菌圈由15.75±0.19 mm減小到12.69±0.26 mm,且90 ℃便使其完全失活;紫外會降低Surfactin抑菌活性,但效果不明顯;糖、鹽對其抑菌效果無顯著性影響;在pH大于5.5的食品中,防腐保鮮效果優(yōu)于Nisin,在米飯中加入適量的Surfactin,可將保質(zhì)期延長24 h,在面包中適宜添加量為200～500 mg/kg。

Surfactin,抑菌穩(wěn)定性,防腐保鮮

Surfactin是由革蘭氏陽性芽孢桿菌通過非核糖體合成途徑產(chǎn)生的具有抗菌作用的脂肽類化合物,中文名稱為表面活性素。它具有廣譜、高效、安全無毒、不易產(chǎn)生耐藥性、易被生物降解等優(yōu)點(diǎn)[1]。由于生物性抗菌肽類防腐劑符合安全、高效、低殘留、生態(tài)的新型防腐劑要求,目前逐漸成為了開發(fā)新型食品防腐添加劑的研究亮點(diǎn)[2-3]。Surfactin的抗菌活性能有效控制食品中有害微生物的滋生,可作為生物防腐劑應(yīng)用在食品防腐保鮮領(lǐng)域[4],主要包括乳制品[5]、肉制品[6-7]等,由于不同結(jié)構(gòu)的抗菌脂肽其物理化學(xué)性質(zhì),如表面活性、最適pH和對熱的穩(wěn)定性等不同,這也就決定其功能和應(yīng)用領(lǐng)域。目前,對Surfactin的研究主要集中在其性質(zhì)與原油開采和環(huán)境治理方面[8],關(guān)于其抗菌性在食品中的應(yīng)用報道不多。因此,對Surfactin抑菌性等相關(guān)性質(zhì)研究對于今后的應(yīng)用有著重要的意義。本文研究了其對pH、溫度、紫外、糖、鹽的抑菌穩(wěn)定性,同時對其在米飯和面包中的應(yīng)用進(jìn)行了初步的實驗,為其在食品行業(yè)中潛在的應(yīng)用價值提供了參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

藤黃微球菌:CMCC 28001

素瓊脂:2%瓊脂,121 ℃滅菌20 min后待用

S1培養(yǎng)基:胰蛋白胨:0.8%;酵母膏:0.5%;葡萄糖:0.5%;氯化鈉:0.5%;磷酸氫二鈉:0.2%;瓊脂1.6%,121 ℃滅菌20 min后待用

牛津杯:(內(nèi)徑6 mm、外徑7.8 mm、高10 mm)

Surfactin樣品(90%純度,淀粉液化芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)及分離純化制得[7]);Nisin:浙江銀象生物工程有限公司;包裝:聚乙烯袋。東北大米、高筋面粉、鹽、雞蛋、白砂糖、酵母粉、奶粉、奶油超市購買。

超凈工作臺SW-CJ-1FD蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱PYX-DHS-50X65上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;全自動滅菌鍋SX-700日本TOMY公司;層次爐附屬醒發(fā)箱SEC-2Y-P廣州三麥機(jī)械設(shè)備有限公司;面團(tuán)攪拌機(jī)SC-10L廣州三麥機(jī)械設(shè)備有限公司;電飯煲美的公司。

1.2實驗方法

1.2.1Surfactin抑菌效價測定采用牛津杯雙層瓊脂法[9]:將滅菌后的2%素瓊脂,倒入無菌平板中,待其冷卻后擺放滅菌牛津杯。將滅菌后的S1培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右,接入藤黃微球菌(106～107cfu/mL的S1液體培養(yǎng)基),混合均勻,傾注平板,待其凝固后取出牛津杯,吸取100 μL 1 mg/mL pH為7的Surfactin水溶液至孔內(nèi),37 ℃培養(yǎng)12 h,用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

Nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:準(zhǔn)確稱取適量Nisin,用0.02 mol/L的鹽酸溶解,分別配制成8000、4000、2000、1000、500、250、100、50 IU/mL。用1.2.1中牛津杯法測定抑菌圈直徑。

1.2.2pH對Surfactin抑菌活性的影響用酸堿溶液調(diào)節(jié)蒸餾水的pH至6、6.5、7、7.5、8,分別用其溶解Surfactin,使其濃度為1 mg/mL,用1.2.1中牛津杯法測定抑菌圈直徑。

1.2.3溫度對Surfactin抑菌活性的影響將配制好的不同pH的Surfactin水溶液,在不同溫度(60、70、80、90、100 ℃)下處理20 min,用1.2.1中牛津杯法測定抑菌圈直徑。

1.2.4紫外對Surfactin抑菌活性的影響吸取適量的1 mg/mL Surfactin水溶液(pH7),置于開蓋無菌玻璃平板中進(jìn)行紫外線照射處理(18W 紫外燈,35 cm),時間分別為0、5、10、20、30、45、60 min。用1.2.1中牛津杯法測定抑菌圈直徑。

1.2.5蔗糖對Surfactin抑菌活性的影響分別配制0%、5%、10%、20%、30%、40%的蔗糖溶液,調(diào)節(jié)至pH7,取蔗糖溶液溶解Surfactin,使其濃度為1 mg/mL。用1.2.1中牛津杯法測定抑菌圈直徑。

1.2.6鹽對Surfactin抑菌穩(wěn)定的影響分別配制0%、1%、3%、5%、7%、9%的氯化鈉溶液,調(diào)節(jié)至pH=7,取氯化鈉溶液溶解Surfactin,使其濃度為1 mg/mL。用1.2.1中牛津杯法測定抑菌圈直徑。

1.2.7Surfactin在米飯、面包中的應(yīng)用分別參考楊云斌[10]和黃巍峰[11]的方法,制作米飯和面包,在包裝前以無菌操作均勻噴灑0.005%、0.02%、0.05%的Surfactin水溶液,以0.02%的Nisin作為陽性對照,無菌蒸餾水作為陰性對照,將以上經(jīng)過處理的米飯和面包放置于25 ℃儲藏。米飯分別在0、12、24、36、48、60、72 h取樣,面包分別在0、1、3、5、7、9 d取樣,米飯測定指標(biāo)為菌落總數(shù)[12]與感官評定[12],面包測定指標(biāo)為菌落總數(shù)[13]、滴定酸度[14]、感官評定[14]。產(chǎn)品變質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)為感官沒有異常,且微生物及理化指標(biāo)在相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。保質(zhì)期為開始保藏到相應(yīng)指標(biāo)超過相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)的時間間隔。

米飯制作過程:大米→水淘洗→水浸泡20 min→電飯鍋煮20 min→冷卻→均勻噴灑防腐劑→包裝

面包制作過程:稱料→和面→基礎(chǔ)發(fā)酵→面團(tuán)松弛→中間醒發(fā)→成型發(fā)酵→焙烤→冷卻→均勻噴灑防腐劑→包裝

注:用無菌玻璃噴霧器將相應(yīng)防腐劑均勻噴灑在樣品表面,米飯在噴灑后攪拌均勻。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行多重比較分析,利用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1Surfactin的效價

Nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1　Nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of Nisin注:指示菌為藤黃微球菌。

1 mg/mL pH為7的Surfactin水溶液對藤黃微球菌的抑菌圈大小為16.76±0.06 mm,代入方程計算出其效價為1884.702±72.407 IU/mg,即為Nisin的1.88倍左右。

2.2pH對Surfactin抑菌活性的影響

在pH6以下,Surfactin的水溶液會產(chǎn)生絮狀沉淀。因此選擇pH>6的環(huán)境中研究其抑菌穩(wěn)定性,而從圖2可以看出,在pH6～pH8的范圍內(nèi),隨著pH的升高,Surfactin的抑菌效果有所下降(p<0.05),但在中性及弱酸性環(huán)境中,下降不明顯。因此,在后期的食品應(yīng)用中,應(yīng)選擇pH為6～7的食品,以發(fā)揮Surfactin的最大抑菌效果。

圖2　pH對Surfactin抑菌活性的影響Fig.2　Effect of pH on antimicrobial activity of Surfactin注：標(biāo)注不同字母表示差異顯著p<0.05，圖4同。

2.3溫度對Surfactin抑菌活性的影響

如圖3所示,溫度和pH對Surfactin的抑菌活性有影響。隨著處理溫度的升高,其抑菌圈在不斷減小,隨著pH的增高,溫度對抑菌效果的影響越來越大。在pH6時,90 ℃以下,抑菌效果幾乎沒有發(fā)生變化(p>0.05)。之后隨著溫度升高,抑菌效果下降也不明顯。而在pH8時,60 ℃就使抑菌圈從15.75±0.19 mm減小到12.69±0.26 mm,在90 ℃時,已經(jīng)完全喪失了抑菌活性,這可能是因為高溫處理會造成Surfactin膠束結(jié)構(gòu)破壞[15]?？偟膩碚f,在弱酸性的條件下,Surfactin抑菌活性隨溫度變化不大,而在弱堿性的條件下,高溫處理使其活性損失嚴(yán)重,即酸性環(huán)境下有利于保護(hù)Surfactin的抑菌活性。這與熊玲[16]報道的結(jié)果相同。

圖3　溫度對Surfactin抑菌活性的影響Fig.3　Effect of tempareture on antimicrobial activity of Surfactin注:C為對照組,未進(jìn)行高溫處理。

2.4紫外線對Surfactin抑菌活性的影響

由圖4可知,抑菌圈直徑在16.98～15.69 mm范圍內(nèi)。隨著紫外照射時間的增加,其抑菌活性逐漸下降(p<0.05)。但在紫外處理60 min后,抑菌活性為對照的92.4%,因此可以認(rèn)為紫外線處理對Surfactin的抑菌活性有一定影響，但影響不大。

圖4　紫外對Surfactin抑菌活性的影響Fig.4　Effect of ultraviolet radiation on antimicrobial activity of Surfactin

2.5蔗糖對Surfactin抑菌活性的影響

由圖5看出,隨著糖濃度的增加,Surfactin的抑菌圈逐漸變大,由開始的16.74 mm增加到17.45 mm,但變化不明顯(p>0.05)。抑菌活性增加可能是由于蔗糖的存在改變了微生物生長環(huán)境的滲透壓,在一定程度上增強(qiáng)了Surfactin的抑制活性。

圖5　蔗糖對Surfactin抑菌活性的影響Fig.5　Effect of sucrose on antimicrobial activity of Surfactin

2.6鹽對Surfactin抑菌活性的影響

由圖6可知,隨著鹽濃度的變化,Surfactin的抑菌濃度在16.36～16.82 mm之間波動,但變化幅度不大。由此可見,Surfactin對鹽有較高的穩(wěn)定性,基本不受到鹽濃度的影響(p>0.05)。這與戴超[17]等的研究報道的結(jié)果相同。

圖6　鹽對Surfactin抑菌活性的影響Fig.6　Effect of salt on antimicrobial activity of Surfactin

2.7Surfactin在米飯、面包中的應(yīng)用

2.7.1不同防腐劑對米飯保藏過程中感官質(zhì)量的影響表1顯示的是25 ℃保藏過程中米飯感官質(zhì)量的變化情況,對照組米飯感官質(zhì)量下降最快。在24 h就出現(xiàn)了異味。在保藏期間,隨著Surfactin濃度的增加,米飯感官質(zhì)量下降減緩。500 mg/kg的處理組到60 h才出現(xiàn)異味,是對照組時間的2.5倍。相同劑量的Surfactin與Nisin相比,出現(xiàn)異味的時間由36 h延長至48 h。

表1　25℃保藏過程中米飯感官質(zhì)量的變化

注:C代表對照;N代表Nisin;S代表Surfactin。

表2　25℃保藏過程中米飯菌落總數(shù)的變化

注:C代表對照;N代表Nisin;S代表Surfactin;數(shù)據(jù)單位為log cfu/g,-表示菌落總數(shù)多不可記;采用鄧肯多重比較法分析,同一行不同字母表示顯著性差異(p<0.05),表3同。

表3　25 ℃保藏過程中面包菌落總數(shù)的變化

2.7.2不同防腐劑對米飯保藏過程中米飯菌落總數(shù)的影響從表2可以看出,Surfactin對微生物抑制作用明顯(p<0.05)。隨著保藏時間的增加,各實驗組米飯菌落總數(shù)均增加,對照組增加最快,其次分別為低劑量Surfactin組、Nisin組、中劑量Surfactin組和高劑量Surfactin組。劑量相同的Surfactin組抑菌效果略好于Nisin組。對照組在24 h左右就發(fā)生了變質(zhì),放置48 h時,其菌落總數(shù)已超過了國家標(biāo)準(zhǔn)[12]中的最高安全限量(log cfu/g≤5),而此時添加中、高劑量的Surfactin菌落總數(shù)的對數(shù)為3.90和3.46。就微生物標(biāo)準(zhǔn)而言,高劑量Surfactin組將保存期從48 h延長至72 h。菌落總數(shù)的變化和感官質(zhì)量變化基本保持一致。

2.7.3不同防腐劑對面包保藏過程中感官質(zhì)量的影響實驗結(jié)果表明,對照組與處理組在感官質(zhì)量方面并無明顯差別。

2.7.4不同防腐劑對面包保藏過程中菌落總數(shù)的影響從表3可以看出,Surfactin能有效抑制微生物的生長(p<0.05)。隨著保藏時間的增加,各實驗組面包菌落總數(shù)均增加,對照組增加最快,其次分別為低劑量Surfactin組、Nisin組、中劑量Surfactin組和高劑量Surfactin組。對照組在25 ℃下放置3 d,其菌落總數(shù)已超過了國家標(biāo)準(zhǔn)[13](log cfu/g≤3.176),而此時添加中、高劑量的Surfactin菌落總數(shù)的對數(shù)為1.67和1.56,遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)[13]。劑量相同的Surfactin組抑菌效果明顯高于Nisin組,相對于對照組,中高劑量Surfactin組將保存期從3 d延長至7 d。

2.7.5不同防腐劑對面包保藏過程中米飯菌落總數(shù)的影響從表4的結(jié)果來看,面包在儲藏前期,總體來說酸度有細(xì)微增加,但增加幅度不大(p>0.05)。加入Surfactin的實驗組酸度增加的速率小于對照組,且隨著劑量增加,酸度增加速率越小。說明Surfactin可以延緩面包在存儲過程中酸度的增加。所有處理組的酸度均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)[14](≤6 °T)。

3　結(jié)論

低pH會使溶液產(chǎn)生絮狀沉淀,在pH6～pH8的范圍內(nèi),隨著pH的升高,抑菌圈大小略有下降。糖和鹽含量對Surfactin抑菌效果影響不大,因此其可以用于鹽、糖含量高的食品中。Surfatin對紫外不是非常敏感,但20 min以上抑菌效果會出現(xiàn)一定的下降,因此在應(yīng)用時應(yīng)考慮紫外照射對Surfactin的影響。溫度對Surfactin抑菌活性影響較大,堿性條件下,隨著溫度的升高,Surfactin抑菌效果下降明顯,而在弱酸性條件下,100 ℃內(nèi),抑菌活性基本保持不變。Surfactin抑菌效價是Nisin的1.88倍,在pH呈弱酸性的食品中具有一定的應(yīng)用前景。

表4　25 ℃保藏過程中面包滴定酸度的變化(°T)

注:C代表對照;N代表Nisin;S代表Surfactin;數(shù)據(jù)單位為°T;采用鄧肯多重比較法分析,同一行不同字母表示顯著性差異(p<0.05)。

米飯防腐應(yīng)用中,綜合感官質(zhì)量和菌落總數(shù)考慮,Surfactin保鮮效果好于Nisin。與對照相比,以微生物指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn),加入適量的Surfactin可以將保質(zhì)期由48 h延長至72 h。面包防腐應(yīng)用中,Surfactin保鮮效果依然好于Nisin。與對照相比,加入適量的Surfactin可以將保質(zhì)期由3 d延長至7 d。從菌落總數(shù)的結(jié)果來看,面包中Surfactin適宜添加量為200～500 mg/kg。

[1]孟攀攀,陸兆新,呂鳳霞. Bacillomycin高產(chǎn)菌株的紫外誘變選育及其防治大米黃曲霉霉變的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015(19):186-189,201.

[2]胡玉偉,王小云,管楚雄. 抗菌肽在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)上的應(yīng)用[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(12):117-121.

[3]宋宏霞,曾名勇,劉尊英. 抗菌肽的生物活性及其作用機(jī)理[J]. 食品工業(yè)科技,2006(9):185-188,197.

[4]Clément C,Aude C,Simon D,et al. Lipopeptides as the Antifungal and Antibacterial Agents:Applications in Food Safety and Therapeutics[J]. International Journal of Biological Sciences,2015,2015(3):1-9.

[5]高曉平,胡惠,黃現(xiàn)青. Surfactin抑制乳中大腸桿菌O157活性研究[J]. 食品科學(xué),2009(11):91-94.

[6]王東,孫力軍,王雅玲. 納豆菌抗菌肽APNT-6對凡納濱對蝦的低溫保鮮效果[J]. 水產(chǎn)學(xué)報,2012(7):1133-1139.

[7]章棟梁. Surfactin工業(yè)分離純化工藝及其對肉品的防腐保

鮮效果[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[8]Mulligan C N,Yong R N,Gibbs B F. Heavy metal removal from sediments by biosurfactants[J]. Journal of Hazardous Materials,2001,85(1):111-125.

[9]高鈺淇,黨麗娟,別小妹. 不同誘變方法選育嗜酸乳桿菌NX2-6類細(xì)菌素高產(chǎn)菌株[J]. 食品工業(yè)科技,2015(9):184-187,193.

[10]楊云斌,周桂飛,周斌. ε-聚賴氨酸對米飯保鮮效果的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2010(9):77-79.

[11]黃巍峰,鄭曉輝,曾遠(yuǎn)平. 微藻DHA在吐司面包中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技,2013(14):292-295.

[12]SB/T 10652-2012,米飯、米粥、米粉制品[S].

[13]GB 7099-2003,糕點(diǎn)、面包衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[14]GB/T 20981-2007,面包[S].

[15]佘安奇. 水溶液中表面活性素的膠束結(jié)構(gòu)與聚集行為的研究[D].上海:華東理工大學(xué),2012.

[16]熊玲,張立彥,劉啟蓮.不同陰離子對乳酸鏈球菌素抑菌穩(wěn)定性的影響研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012(23):306-308,313.

[17]戴超,郭芳芳,陸兆新.脂肽類生物表面活性劑Surfactin的乳化性[J].食品科學(xué),2015(15):40-44.

Study on antimicrobial stability and application of Surfactin in food

WANG Shui-cheng,ZENG Wei-wei,LU Zhao-xin*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

The effects of temperature,ultraviolet,pH,salts and sucrose on biological stability of Surfactin were investigated. The results showed that in weakly acidic solutions,the antibacterial activity of Surfactin changed little with temperature. After being processed under pH6,100 ℃ for 20 min,the diameter of the inhibition zone for Micrococcus luteus was varied from 17.52±0.22 mm to 16.44±0.03 mm. While Surfactin was processed in the alkaline(pH8)at 60 ℃ for 20 min,which can highly inhibit its bioactivity,the diameter of the inhibition zone was varied from 15.75±0.19 mm to 12.69±0.26 mm. It completely lost activity after treatment of pH8,90 ℃. Ultraviolet inhibited the antibacterial activity,but the effect was not obvious,while sucrose and salt had no significant influence. The preservative experiment results showed that the effect of Surfatin was much better than Nisin in foods whose pH was higher than 5.5. Adding an appropriate amount of Surfactin the rice might extend the shelf life of 24 h and the suitable dosage of Surfactin for bread was 200～500 mg/kg.

Surfactin;antibacterial stability;anticorrosion and preservation

2015-12-16

汪水呈(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail:2013108005@njau.edu.cn。

陸兆新(1957-)，男，博士，教授，研究方向：酶工程和食品生物技術(shù)，E-mail：fmb@njau.edu.cn。

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAD23B05)。

TS202

A

1002-0306(2016)13-0257-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.044