趙　軍，陳澤平，李　楨，宋小寧，李玉鋒（西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039）

二重LAMP檢測雞蛋污染致病菌

趙軍，陳澤平，李楨，宋小寧，李玉鋒*
（西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039）

為快速檢測污染雞蛋的致病菌，實驗從雞蛋蛋體表面得到2株菌X1、X2，結(jié)合16S rRNA克隆及質(zhì)粒測序分子方法對2株菌分類分析，發(fā)現(xiàn)2株菌X1和X2分別為：蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus NC7401（AP007209）、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（AP003088）。針對兩種菌的nhe、nuc基因具有較強的保守性，設(shè)計2套環(huán)介導等溫擴增（LAMP）引物。先進行反應(yīng)體系優(yōu)化，得到25 μL LAMP反應(yīng)體系最適溫度為60℃、最適MgSO4添加量為1.5 μL，引物最適量為2.0 μL。再進行二重LAMP鑒定2株污染雞蛋的致病菌，發(fā)現(xiàn)目的菌X1和X2的特異性擴增結(jié)果為陽性，其他9株非目的菌擴增結(jié)果為陰性，其靈敏度檢測限達10 fg/μL。此二重LAMP檢測法有快速、特異、靈敏的特點，可快速檢測食源性致病菌。

雞蛋，致病菌，16S rRNA，環(huán)介島等溫擴增技術(shù)，快速檢測

現(xiàn)階段我國及世界對食品安全關(guān)注度越來越高。雞蛋營養(yǎng)豐富，在我國的人均食用量逐年升高，近年來雞蛋卻經(jīng)常出現(xiàn)食源性致病菌污染的安全問題，成為國內(nèi)外消費者關(guān)注的焦點［1-2］。雞蛋會被沾上的糞、毛等污染物“二次污染”，常見的致病菌沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等通過蛋殼表面殘留物進行生長、代謝、傳播［3-4］，增加了食品安全的風險。

環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)［5］是日本學者2000年發(fā)明的一種新型的恒溫核酸擴增技術(shù)，因其獨特的核酸反應(yīng)機理，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上會呈現(xiàn)出其典型的階梯狀條帶，結(jié)果鑒定方便快捷，非常適合食源性致病菌的快速檢測。LAMP技術(shù)以特有的靈敏、快速、特異等優(yōu)勢，現(xiàn)已被逐漸應(yīng)用于病原微生物的檢測：如分支桿菌屬、阪崎腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等［6-9］。Kayo-ko Ohtsuka等［10］抽樣檢測了110個可能被沙門氏菌感染的水樣雞蛋，使用LAMP技術(shù)對沙門氏菌的檢出率為100%。李玉鋒等［11］選用了不耐熱腸毒素基因設(shè)計出LAMP引物，優(yōu)化了LAMP的反應(yīng)條件，并且考察了方法的特異性和靈敏性。相關(guān)報道但均未研究雞蛋表面的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌，且采用LAMP檢測法均為單重，檢測效率較低。實驗從污染雞蛋蛋體上分離致病菌，用16S rRNA分子方法和克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果在NCBI中比對其在種屬上分類。根據(jù)種屬結(jié)果和特異性毒力因子基因設(shè)計兩種致病菌的二重LAMP特異性引物。用二重LAMP進行快速、準確鑒定分離的雞蛋致病菌，為二重LAMP鑒定食源性致病菌提供參考和理論依據(jù)。

1　材料及方法

1.1材料與儀器

雞蛋成都市郫縣的10個大型超市中隨機購買鮮雞蛋各10枚，個重0.045～0.055 kg，立即裝入無菌冰袋中密封保存；單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp）、面包酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive E.coli）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxingenic E.coli）四川省疾控中心；細菌基因組DNA提取試劑盒上海偉杰生物工程有限公司；pGEM-T easy載體系統(tǒng)和質(zhì)粒小量提取試劑盒成都敬道生物有限公司；PCR試劑和LAMP試劑引物上海生工公司；DNA Marker DL2000和Premix ExTaq酶寶生物工程（大連）有限公司。

DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠；低速離心機北京醫(yī)用離心機廠；Eppendorf PCR儀

德國Eppendorf公司；臺式離心機上海安亭科學儀器廠；1DHG-9140型電熱恒溫水浴鍋上海精密實驗設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株分離無菌條件下將樣品分別用200 mL 0.85%的無菌生理鹽水沖洗，將所得混懸液使用無菌生理鹽水以10倍的梯度逐步稀釋，選取合適的3個稀釋度。取所得梯度稀釋的各種混懸液0.1 mL無菌條件分別涂布于5%血瓊脂培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。在血瓊脂平板上生長出了中等大小2株菌，編號為X1、X2號。

1.2.2基因組DNA提取及未知菌鑒定

1.2.2.1細菌DNA的提取使用細菌基因組DNA提取試劑盒，按說明書步驟實驗：取菌液1.5 mL，離心后加緩沖液GA懸浮，37℃處理30 min，加入20 μL蛋白酶K混勻加入220 μL緩沖液GB，混勻后70℃溫浴30 min。加入220 μL無水乙醇振蕩混勻后移入吸附柱CB3中，離心后加入500 μL緩沖液GD后離心。向吸附柱提加入600 μL漂洗液PW，離心，最后加入75 μL洗脫緩沖液TE離心至收集管，即提取到細菌的基因組DNA。在0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取菌株的DNA。 1.2.2.2未知菌株的PCR擴增正向引物：Eu27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，10 μmol·L-1）；反向引物：1 490R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，10 μmol·L-1）。

PCR擴增PCR反應(yīng)體系（25 μL）：ddwater 16 μL、10×Taq緩沖液（冰上解凍）2 μL、dNTP（冰上解凍）2 μL、MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL、上下引物和模板各1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL。

PCR條件：95℃預熱5 min，95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.2.3重組質(zhì)粒構(gòu)建及16S rRNA鑒定對菌16S rRNA基因與pGEM-T easy進行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)，采用菌落PCR方法挑選陽性克隆子。選擇鑒定為陽性的克隆子擴培，提取質(zhì)粒，酶切、測序鑒定。鑒定測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。測序結(jié)果通過16S rRNA序列校對后，與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫做相似性分析，選取相似度為99%的菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)X1和X2分別為：蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus NC7401（AP007209）、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（AP003088）。對Bacillus cereus的nhe和Staphylococcus aureus的nuc基因進行二重LAMP鑒定。

1.2.3二重LAMP鑒定致病菌

1.2.3.1LAMP引物設(shè)計比較GeneBank數(shù)據(jù)庫中相似菌株序列，顯示nhe和nuc基因保守性好，采用LAMP引物設(shè)計的在線網(wǎng)站（http：//primerexplorer.jp/e/）進行引物的設(shè)計，依據(jù)LAMP引物設(shè)計的特點，選取了2組LAMP引物分別包括外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP，如表1。

1.2.3.2單重LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化用分離的致病菌X1進行單重LAMP實驗，對反應(yīng)體系進行優(yōu)化。先確定25 μL反應(yīng)體系中成分：10×Thermopol Buffer 2.5 μL；Betaine（4 mol/L）5 μL；4種引物各（F3∶B3∶FIP∶BIP=5∶5∶40∶40，μmol/L）2 μL；Bst DNA polymerase large fragment（8 U）1 μL；dNTPs（10 mmol/L）4 μL；MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL；模板1 μL；滅菌去離子水2 μL。

對影響擴增效率較大的Mg2+濃度、溫度及引物濃度進行優(yōu)化。在60℃條件下，Mg2+添加量分別設(shè)定為：1.3、1.5、1.6、1.7 μL。在Mg2+添加量為1.5 μL時，擴增溫度分別設(shè)定為：58、60、62、64℃。在上述兩個單因素結(jié)果基礎(chǔ)上，引物濃度分別設(shè)定為：1.8、2.0、2.2、2.4 μL。對比擴增結(jié)果，依據(jù)2種LAMP擴增效率相同的原則，最終確定25 μL的二重LAMP反應(yīng)溫度，引物濃度和Mg2+濃度。

表1　兩種食源性致病菌LAMP引物Table 1　Specific primer sequences for LAMP

1.2.3.3二重LAMP特異性檢測致病菌把2套引物加入到優(yōu)化后的同一反應(yīng)體系（25 μL）中，以2株菌株X1和X2及非目標菌株的基因組DNA為模板分別進行LAMP檢測，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，驗證該方法檢蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的準確性及特異性。

1.2.3.4二重LAMP靈敏性檢測將致病菌蠟樣芽孢桿菌X1、金黃色葡萄球菌X2的DNA模板（100 ng/μL）進行10倍梯度稀釋為100～10-7倍至1 fg/μL，進行LAMP擴增，電泳檢測結(jié)果。重復擴增該二重LAMP實驗2次，取實驗效果最好一組。

2　結(jié)果與分析

2.1致病菌PCR和質(zhì)粒測序

用細菌通用引物27 f和1492 r對2株菌進行16S全長序列的PCR擴增，擴增結(jié)果如圖1中A所示。對陽性克隆子進行質(zhì)粒提取，結(jié)果如圖1中B所示。

圖1　細菌PCR擴增（A）和質(zhì)粒提?。˙）圖譜Fig.1　PCR amplification（A）and plasmid extraction（B）

由圖1知PCR擴增效果明顯，2株菌的16S rRNA擴增均重復性好，清晰穩(wěn)定。產(chǎn)物分子大小在2000 bp左右，符合原核微生物的16S rRNA基因片段大小［12］，達到了對致病菌的16S rRNA基因［13］的PCR擴增目的，也證實了所得菌的DNA提取比較成功。為了簡便高效的檢測出分離菌株的分類學地位，實驗對PCR產(chǎn)物做克隆分析。圖1中B質(zhì)粒DNA分子大小在2000 bp和1200 bp之間，和PCR擴增細菌16S rRNA目的基因大小相符［14］，證明了克隆實驗比較成功。通過電泳檢測到完整的16S rRNA基因。將質(zhì)粒進行測序，通過16S rRNA序列校對后，與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫做相似性分析，選取相似度99%的菌株結(jié)果發(fā)現(xiàn)X1和X2分別為：蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus NC7401（AP007209）、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（AP003088）。Bacillus cereus的nhe和Staphylococcus aureus的nuc基因可以表達出腸毒素，引起人體腹瀉，具有較強的致病性［15-16］。

2.2蠟樣芽孢桿菌LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

對Mg2+濃度、溫度及引物濃度這三個反應(yīng)條件進行優(yōu)化。蠟樣芽孢桿菌LAMP反應(yīng)結(jié)果在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測如下：

圖2　LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化圖譜Fig.2　Electrophoresis of LAMP products

由圖2組圖中的特異性梯狀條帶可以知道LAMP反應(yīng)較理想，所設(shè)計的針對nhe基因的引物可以特異性且準確的鑒定出從雞蛋中分離的致病菌（X1）蠟樣芽孢桿菌，且實驗重現(xiàn)性好，條帶清晰。由圖2A中可以得到25 μL LAMP反應(yīng)體系最適MgSO4添加量為1.5 μL，由圖2B可知最適溫度為60℃，由圖2C知引物最適濃度為2.0 μL。以蠟樣芽孢桿菌的LAMP擴增檢測為基礎(chǔ)進行LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化，擴增條件的確定為進一步二重LAMP鑒定兩種致病菌打下基礎(chǔ)。實驗中優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件只用了一株菌進行實驗，得到的條件再進行多重LAMP反應(yīng)，可以快速方便得到較優(yōu)的實驗條件，但是也有不足：不能確定最優(yōu)的二重LAMP反應(yīng)的條件，所以二重LAMP反應(yīng)條件有待進一步研究和進一步優(yōu)化。

2.3二重LAMP特異性檢測分離致病菌

采用二重LAMP特異性檢測分離的2種致病菌X1、X2，結(jié)果如圖3所示。

圖3LAMP特異性檢測致病菌圖譜Fig.3　Detection specificity of LAMP reaction for strain

由圖3可以知道LAMP擴增結(jié)果中致病菌X1、X2條帶呈梯狀，結(jié)果為陽性。其他9株菌（圖3中1～9）無梯狀條帶，擴增結(jié)果為陰性。對比0中的空白對照可以知道陽性結(jié)果準確。表明二重LAMP檢測污染雞蛋的兩種致病菌X1蠟樣芽孢桿菌、X2金黃色葡萄球菌較成功，且反應(yīng)快速、簡便特異性強，為快速檢測雞蛋致病菌提供依據(jù)。實驗中兩套引物在11種不同DNA模板環(huán)境中還能相互特異的擴增，表明引物特異性強。實驗采用二重LAMP對分離致病菌進行一步檢測，比傳統(tǒng)的PCR和現(xiàn)階段的單重LAMP更加方便、快捷，且反應(yīng)的特異性強，靈敏度高，足見在檢測致病菌有較多的優(yōu)勢。但多重LAMP隨著檢測樣的增多，前期合成和互配篩選特異性引物工作量大，且引物數(shù)量隨樣品增多也成倍增加，引物間相互干擾和其他綜合反應(yīng)增多，使得不確定因素增多，使得多重LAMP反應(yīng)相對困難。實驗中的雞蛋污染致病菌由于經(jīng)過擴增培養(yǎng)，其DNA可以較好提取，進而方便快速進行二重LAMP鑒定，這為相對污染程度較低的加工包裝食品致病菌快速檢測提供參考。

2.4LAMP特異性檢測分離致病菌的靈敏度

對兩種雞蛋污染致病菌的模板質(zhì)量濃度從10 ng/μL DNA進行10倍梯度稀釋至10-7倍（1 fg/μL），即DNA模板質(zhì)量濃度10、1 ng/μL，100、10、1 pg/μL，100、10、1 fg/μL進行LAMP擴增，電泳結(jié)果如圖4所示。

圖4　LAMP靈敏度圖譜Fig.4　The sensitivity of LAMP

由圖4知二重LAMP靈敏度檢測效果較理想，兩菌DNA模板進行10倍梯度稀釋至10-6倍（10 fg/μL）仍能擴增出較清晰的梯狀條帶，而稀釋至10-7倍（1 fg/μL）的低濃度時則檢測不出。比較易海華等［17］用LAMP檢測單增李斯特菌中的靈敏度結(jié)果1.72×101拷貝/反應(yīng)模板量，檢測度高，實驗結(jié)果的靈敏度與之相差較小，進一步證明二重LAMP反應(yīng)中靈敏度受多種引物及模板的影響較小。對比姜侃、呂沁風等［18］在三重LAMP進行食品致病菌檢測中的PCR檢測度10 pg/μL，發(fā)現(xiàn)實驗中采用二重LAMP擴增檢測雞蛋污染致病菌靈敏度能高于普通PCR擴增檢測限1000倍。表明了二重LAMP鑒定雞蛋污染致病菌靈敏度高的特點。

實驗結(jié)果檢測還可以通過觀察LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的焦亞硫酸鎂沉淀［19］和SYBR-GREENⅠ染色［20］后在紫外呈黃色的方法。還可以進一步結(jié)合熒光定量［21］實時直觀的探究擴增過程。本實驗只是用較簡便的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到比較理想的陽性檢測結(jié)果。但LAMP反應(yīng)只有陰性和陽性兩種結(jié)果，實驗時容易出現(xiàn)假陽性，且檢測靈敏度太高而容易導致污染，給結(jié)果帶來較大影響。故需要注意在不同房間、地點進行不同種屬菌的二重LAMP反應(yīng)試劑添加，人員互換避免污染而出現(xiàn)假陽性，且反應(yīng)靶序列長度控制在300 bp以下，一旦產(chǎn)生非特異性擴增，則不易鑒別［22］。如果進一步改進和完善LAMP的這些不足，可以使二重LAMP在食品、衛(wèi)生鑒定致病菌方面運用的潛力更巨大。

3　結(jié)論

通過對污染雞蛋的微生物進行分離純化，得到2株菌X1和X2。用16S rRNA和克隆的分子方法對分離的細菌進行鑒定。在基因庫中對比選擇相似度高達99%的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2株菌X1和X2分別為：蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus NC7401（AP007209）、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（AP003088）。

針對兩種致病菌X1和X2的毒力致病因子基因nhe、nuc有保守度高，特異性強的特點設(shè)計2對不同特異性LAMP引物，進行單因素實驗優(yōu)化反應(yīng)條件得到25 μL LAMP反應(yīng)體系最適溫度為60℃、最適MgSO4添加量為1.5 μL，引物最適濃度為2.0 μL。再用二重LAMP反應(yīng)對致病菌檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二重LAMP雖然受到不同菌株的引物、模板及濃度等多種因素影響，使綜合反應(yīng)復雜，但是仍然可特異性、準確的鑒定出目的致病菌X1和X2，而非目的菌均未出現(xiàn)特異性擴增結(jié)果。二重LAMP反應(yīng)鑒定致病菌靈敏度也較高，達到10 fg/μL，這比劉昊、黃文勝等［23］用LAMP方法檢測開心果DNA中的0.2 ng/L靈敏度還高。表明此方法可以快速、方便、準確的鑒定雞蛋污染致病菌。為進一步研究二重LAMP試劑盒以快速檢測食品中蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌提供理論依據(jù)。

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Multiplex LAMP method for the detection of pathogenic bacteria in eggs

ZHAO Jun，CHEN Ze-ping，LI Zhen，SONG Xiao-ning，LI Yu-feng*
（College of Food and Biological Engineering，Xihua University，Chengdu 610039，China）

Two strains of bacteria named X1，X2were found to detect the pathogenic bacteria on eggs.Combined with 16S rRNA molecule methods，testing the cloned plasmid sequence，blasting the sequence with NCBI in GenBank.The results showed that X1was Bacillus cereus NC7401（AP007209）and X1was Staphylococcus aureus（AP003088）.According to the highly conservative gene nhe and nuc，two sets of primers were designed. The optimized LAMP reaction system contained MgSO41.5 μL，each primer 2.0 μL and reaction temperature of 60℃.The specificity was verified by using 9 strains of non-targeting bacteria and targeting bacteria X1，X2. The LAMP assay showed a sensitivity of 10 fg/μL.The novel multiple LAMP method reported here was characteristics of rapid detection，high specificity and excellent sensitivity，which could be applied in the detection of pathogenic bacteria.

egg；pathogenic bacteria；16S rRNA；loop-mediated isothermal amplification；rapid detection

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0107-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.012

2015－07－17

趙軍（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：137495917@qq.com。

李玉鋒（1965-），男，博士研究生，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：907493056@qq.com。